Kiemelt különbség – RAPD vs RFLP
A molekuláris biológiában a genetikai markereket az egyedek és fajok közötti genetikai eltérések azonosítására használják. A véletlenszerű amplifikált polimorf DNS (RAPD) és a restrikciós fragmens hosszúságú polimorfizmus (RFLP) két fontos molekuláris marker, amelyet rutinszerűen használnak a laboratóriumokban. A RAPD-t rövid és tetszőleges oligonukleotid primerekkel hajtják végre, és a szervezet templát DNS-ében található több hely véletlenszerű amplifikációján alapul. Az RFLP-t specifikus restrikciós endonukleázzal hajtják végre, és a kapott restrikciós fragmensek polimorfizmusán és hibridizáción alapul. A legfontosabb különbség a RAPL és az RFLP között az, hogy a RAPD egyfajta PCR-technika, amelyet előzetes szekvenciaismeret nélkül hajtanak végre, míg az RFLP nem vesz részt a PCR-ben, és előzetes szekvenciaismeretet igényel a technika végrehajtásához.
Mi az a RAPD?
A RAPD hasznos molekuláris marker a molekuláris biológiában. Ez egy gyors és egyszerű technika. A RAPD olyan módszerként definiálható, amely polimorf DNS-szekvenciákat eredményez a cél DNS-templát több helyének véletlenszerű amplifikációja eredményeként. A RAPD rövid oligonukleotid primereket használ tetszőleges szekvenciákkal a PCR-amplifikációhoz. A primereket mesterségesen szintetizálják a szekvencia előzetes ismerete nélkül. Ezért ez egy egyszerű és hasznos technika.
A következő főbb lépések a RAPD-hez tartoznak.
- Cél DNS kinyerése
- A cél DNS több helyének amplifikációja véletlenszerűen kiválasztott primerekkel
- Az amplifikált PCR-termékek gélelektroforézise
- Festés etidium-bromiddal és a polimorfizmus azonosítása
A primer annealing változatossága következtében az amplifikáció során különböző hosszúságú, különböző fragmentumok keletkeznek. Ezért a gélek sávozási mintái egyedenként és fajonként eltérőek. Így a RAPD lehetővé teszi az élőlények közötti genetikai variációk kimutatását az azonosítás és a differenciálódás során.
A RAPD-t különféle molekuláris biológiai tanulmányokban alkalmazzák, mint például a közeli rokon fajok közötti genetikai különbség azonosítása, géntérképezés, DNS-ujjlenyomat-vétel, öröklött betegségek azonosítása stb.
01. ábra: RAPD
Mi az RFLP?
A Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP-k) egy molekuláris marker, amelyet a molekuláris biológiában használnak a homológ DNS-szekvenciák genetikai variációinak azonosítására. Ez az első genetikai marker, amelyet DNS-ujjlenyomat-vételre fejlesztettek ki. Minden szervezet egyedi DNS-profilt állít elő, ha specifikus restrikciós enzimekkel korlátozzák. Az RFLP fontos eszközként szolgál az egyedek egyedi DNS-profiljainak létrehozásában és a köztük lévő genetikai variációk kimutatásában. Ha a DNS-mintákat specifikus restrikciós endonukleázokkal emésztjük, az különböző DNS-profilokat eredményez, amelyek minden egyedre egyediek. Ezért ennek a módszernek az elve az élőlények közötti genetikai variációk kimutatása a homológ DNS specifikus restrikciós enzimekkel történő restrikciójával, valamint a fragmenshosszúság polimorfizmusának gélelektroforézissel és blottal történő elemzése. A blottolási minták minden szervezetnél egyediek, és az adott genotípust jellemzik.
A következő lépések az RFLP-vel kapcsolatosak.
- Elegendő mennyiségű DNS izolálása a mintákból
- DNS-minták fragmentálása specifikus restrikciós endonukleázokkal rövid szekvenciává
- A kapott, különböző hosszúságú fragmentumok szétválasztása agaróz gélelektroforézissel.
- A gélprofil átvitele membránba Southern blotting segítségével
- A membrán hibridizálása jelölt próbákkal és a fragmentumhossz polimorfizmus elemzése az egyes profilokban
Az RFLP-nek különféle alkalmazásai vannak, mint például az öröklődő betegségek diagnosztizálása, genomtérképezés, bűnügyi azonosítás a törvényszéki vizsgálatok során, apasági vizsgálat stb.
02. ábra: RFLP genotipizálás
Mi a különbség a RAPD és az RFLP között?
RAPD vs RFLP |
|
| A RAPD egy véletlenszerű primereken és PCR-en alapuló molekuláris marker. | RFLP egy molekuláris marker, amely különböző hosszúságú restrikciós fragmentumok előállításán alapul. |
| Szükséges minta | |
| Kis DNS minták elegendőek a RAPD elemzéshez. | Nagy mennyiségű kivont DNS-mintára van szükség az RFLP elemzéshez. |
| Idő | |
| RAPD egy gyors folyamat. | Az RFLP időigényes folyamat. |
| Primer használata | |
| Véletlenszerű primereket használnak, és ugyanazok a primerek különböző fajokhoz használhatók. | Fajspecifikus próbákat használnak az RFLP-ben a hibridizációhoz. |
| Megbízhatóság | |
| A technika megbízhatósága kisebb az RFLP-hez képest. | RFLP egy megbízható technika. |
| Blotting | |
| A RAPD Southern blottingot tartalmaz. | Southern blotting az RFLP egy lépése. |
| Allelikus variáció kimutatása | |
| A RAPD nem észleli az allélvariációkat. | Az RFLP képes kimutatni az allélvariációkat. |
| Szekvenciaismeretre van szükség | |
| A RAPD-hez nem szükséges előzetes szekvenciaismeret. | A szondatervezéshez előzetes szekvenciaismeret szükséges. |
| PCR | |
| A PCR részt vesz a RAPD-ben | A PCR nem kapcsolódik az RFLP-hez. |
| Reprodukálhatóság | |
| A RAPD-nek alacsony a reprodukálhatósága | Az RFLP a RAPD-hez képest jó reprodukálhatósággal rendelkezik. |
Összefoglaló – RAPD vs RFLP
A RAPD és az RFLP a molekuláris biológiában használt fontos markerek. Mindkét módszer alkalmas az élőlények közötti genetikai variációk kimutatására. A RAPD-t véletlenszerű primerekkel hajtják végre. Az RFLP-t specifikus restrikciós enzimek segítségével hajtják végre. Mindkét módszer egyedi DNS-profilokat állít elő az egyes szervezetekre. A RAPD viszonylag kevés lépést tartalmaz, mint az RFLP. De kevésbé megbízható és reprodukálható eredményeket ad, mint az RFLP. Ez a fő különbség a RAPD és az RFLP között.
