Fő különbség – klónozás és szubklónozás
A klónozás és a szubklónozás olyan molekuláris biológiai eljárások, amelyek genetikailag azonos sejteket vagy organizmusokat hoznak létre, amelyek az érdeklődésre számot tartó DNS-t vagy gént hordozzák. A klónozás egy olyan technika, amely magában foglalja az érdekelt gén vagy DNS beépítését egy vektorba, replikációját egy gazdabaktériumban, és olyan sejtek vagy organizmusok előállítását, amelyek a genetikai felépítés pontos másolatai. A szubklónozás egy olyan technika, amely magában foglalja a kérdéses gén beépítését, amely már be van építve egy vektorba, egy másodlagos vektorba, replikációját egy gazdabaktériumban, és genetikailag azonos sejtek vagy organizmusok másolatait állítja elő. A klónozás és a szubklónozás közötti kulcsfontosságú különbség az, hogy a klónozás során a kérdéses gén, miután egy vektorba ligálódott, folytatja a klónozási folyamatot, míg a szubklónozás során a már klónozott érdeklődésre számot tartó gént elválasztják a szülővektortól, és ismét beillesztik egy címzett vektort, és folytassa a folyamatot.
Mi a klónozás?
A klónozás az az eljárás, amely genetikailag azonos organizmusokat vagy sejteket állít elő. A természetben a klónozás az ivartalan szaporodás útján történik. Ha nincs genetikai rekombináció vagy változás, a leánysejtek ugyanazt a genetikai felépítést kapják, mint a szülő. A prokarióta és eukarióta szervezetek klónokat hoznak létre bináris hasadással, bimbózással, mitózissal stb. A molekuláris biológiában a gének vagy specifikus DNS-fragmensek klónozása népszerű módszer az adott DNS-szakasz szerkezetének és működésének tanulmányozására.
A molekuláris klónozás fő célja, hogy több millió másolatot készítsen genetikailag azonos sejtekről vagy organizmusokról, amelyek a kérdéses DNS-fragmenst (főleg géneket) hordozzák. Olyan organizmusokat hoz létre, amelyek egy másik genetikai másolatát tartalmazzák. Elsősorban specifikus géneket klónoznak molekuláris vizsgálatok során, hogy szerkezeti és funkcionális információkat nyerjenek, valamint DNS szekvenálást végezzenek. Ezenkívül a klónozást széles körben alkalmazzák bizonyos fehérjék vagy termékek nagy léptékű előállítására.
Klónozási eljárás
A klónozási eljárás alapvető lépései a következők.
- A kérdéses gén azonosítása és izolálása. (A kérdéses gén amplifikációja PCR-rel).
- A kérdéses gén restrikciós emésztése (a restrikciós endonukleáz elvágja a gént).
- A vektor DNS restrikciós emésztése. (A vektor-DNS-t is ugyanazzal a restrikciós endonukleázzal vágjuk.)
- A gén beépítése a vektorba és a rekombináns molekula kialakulása.
- A rekombináns vektor átalakítása gazdabaktériummá.
- A transzformált baktériumok izolálása és azonosítása (a plazmidvektornak tartalmaznia kell egy szelektálható gént, leggyakrabban egy antibiotikum rezisztencia gént a transzformált baktériumok szűrésére).
- Rekombináns génexpresszió a gazdaszervezeten belül.
Ábra_01: Klónozási eljárás
Mi az a szubklónozás?
A szubklónozás egy olyan eljárás, amelynek során a kérdéses gént egyik vektorból egy másik vektorba helyezzük át, hogy lássuk a gén expresszióját, és így elérjük a gén kívánt funkcionalitását. Ebben a módszerben két vektor vesz részt; nevezetesen a szülővektor és a célvektor. A klónozott inszertek ismét egy második vektorba kerülnek a szubklónozás során. A génnek az első vektorból a második vektorba való átvitelének célja az, hogy olyasmit kapjunk, amit az első vektor nem tudna megtenni, vagy hogy egy gént ismét elkülönítsünk a már klónozott DNS-fragmensen belül, és azt önmagában expresszáljuk. Az eljárás elején restrikciós enzimeket használnak.
Subklónozási eljárás
A szubklónozás alapvető lépései a következők.
- Restrikciós endonukleázok segítségével a donor plazmidban (szülővektor) a kérdéses DNS elválasztása.
- A kérdéses DNS amplifikációja PCR-rel.
- A PCR-termék (érdekes DNS) tisztítása gélelektroforézissel.
- A recipiens plazmid megnyitása ugyanazokkal a restrikciós endonukleázokkal, amelyeket a szülőplazmidban a számunkra érdekes DNS elválasztására használtunk.
- A kérdéses DNS (gén) ligálása a recipiens plazmidba a szubklónozott plazmid létrehozása érdekében.
- A szubklónozott vektor transzformációja kompetens gazdabaktériummá.
- A transzformált sejtek szűrése.
- A plazmid DNS tisztítása és a DNS szekvenálására vagy a gének expressziójára történő felhasználás a kívánt termékek előállításához.
A szubklónozást olyan alkalmakkor hajtják végre, amikor egy gént izolálnak a klónozott gének csoportjából, vagy amikor a kérdéses gént egy hasznos plazmidba kell átvinni a kérdéses gén pontos funkciójának megtekintéséhez.
Ábra_02: Alklónozási eljárás
Mi a különbség a klónozás és a szubklónozás között?
Klónozás kontra szubklónozás |
|
| A klónozás az az eljárás, amely genetikailag azonos organizmusokat vagy sejteket állít elő. | A szubklónozás egy olyan eljárás, amelynek során a kérdéses gént egyik vektorból egy másik vektorba helyezzük át, hogy lássuk a gén expresszióját, és így elérjük a gén kívánt funkcionalitását. |
| Folyamat | |
| Válassza el a kérdéses DNS-t a szervezettől, és helyezze be egyszer egy vektorba, majd klónozza | A már klónozott DNS-t elválasztják az első vektortól, és beillesztik egy második vektorba, és klónozzák. |
| Mozgás beszúrása vektorokon keresztül | |
| Nem helyezi át az inszerteket (érdekes DNS-t) egyik vektorból a másikba. | Beszúrások áthelyezése szülővektorból a célvektorba. |
Összefoglaló – Klónozás kontra szubklónozás
A klónozás genetikailag azonos sejteket vagy organizmusokat hoz létre a beillesztett génnel vagy DNS-sel. Ez a kérdéses DNS elválasztásán és vektorba történő beépítésén, valamint a gazdabaktériumban történő expresszión keresztül megy végbe. A szubklónozás hasonló lépéseket tesz a klónozáshoz. A szubklónozás során azonban a már klónozott DNS-fragmenst (érdeklődésre számot tartó gént) vektorba inszertáljuk, és gazdabaktériummá transzformáljuk. Ez a legfontosabb különbség a klónozás és a szubklónozás között.
