Fő különbség – tompa és ragadós végű lekötés
A restrikciós endonukleázok olyan specifikus enzimek, amelyek kettévágják a kétszálú DNS-t (dsDNS). A molekuláris biológiában molekuláris ollóként is ismertek. A restrikciós enzimek képesek felismerni a dsDNS specifikus rövid szekvenciáit, amelyek felismerési helyként ismertek, és foszfodiészter- és hidrogénkötéseket hasítanak fel, így kettős szálakat nyitnak meg. Az enzimek általi hasítás eredményeként különböző típusú végű DNS-fragmensek keletkeznek, például ragadós végekkel és tompa végekkel. A DNS-ligáz egy olyan enzim, amelyet a molekuláris biológiában használnak két szomszédos DNS-szál összekapcsolására új kötések kialakításával. Ezt a lépést ligálásnak nevezik, és a ligált DNS-vég típusától függően nevezhetjük tompa vég ligálásnak és ragadós vég ligálásnak. A legfontosabb különbség a tompa és a ragadós végek ligálása között az, hogy a tompa vég ligálása a két tompa véget tartalmazó DNS-fragmensek között történik, míg a ragadós végek ligálása az 5' és 3' túlnyúlások között történik. A tompa végű lekötéshez képest a ragadós véglekötés hatékonyabb és stabilabb.
Mi az a tompa végű lekötés?
Egyes restrikciós endonukleázok az ellentétes bázisokon elvághatják a DNS-t, és tompa végű DNS-fragmenseket hozhatnak létre. Ezeket az enzimeket tompa végvágóként ismerik; egyenesen a restrikciós hely közepéig hasadnak anélkül, hogy egyszálú, túlnyúló bázisokat hagynának. A tompa végeket nem túlnyúló végeknek is nevezik, mivel nincs 3’ és 5’-es túlnyúló alap a végükön. Mindkét szál bázispárból tompa végekkel végződik. A gyakori tompavéget vágó enzimek az EcoRV HaeIII, AluI és SmaI.
A tompa vég lekötése két tompa vég között történik. Ez nem a kiálló alapok lekötése. Ez a lekötés kevésbé hatékony, mint a ragadós végű lekötés. Egyes esetekben azonban a tompa végek ligálása előnyösebb, mint a ragadós végek ligálása, különösen a PCR-termékek ligálásakor. A PCR-termékek mindig tompa végekkel készülnek. A tompa végű ligáláshoz nincs szükség komplementer végekre a DNS-ben a ligáláshoz.
01. ábra: Tompa végtermék az Eco RV enzim által
Mi az a ragadós végű lekötés?
Egyes restrikciós endonukleázok képesek levágni a dsDNS-t, így a végén egy kilógó egyszálú DNS-darabot hagynak hátra. Ezeket a végeket ragadós vagy túlnyúló végeknek nevezik. A ragadós végek ligálása két olyan DNS-fragmens között megy végbe, amelyek egyező túlnyúlásokat tartalmaznak, mivel a ragadós végek párosítatlan bázisokkal rendelkeznek, és komplementer bázisokra van szükségük a kötések kialakításához. Ezért ugyanazt a restrikciós enzimet kell használni mindkét DNS-forráshoz az egyező ligáló fragmentumok előállításához.
A ragadós végek ligálása hatékonyabb, és gyakran nagyon kívánatos a klónozási eljárásokban. Számos restrikciós enzim létezik, amelyek ragacsos végeket termelnek. Ezek EcoRI, BamHI, HindIII stb.
02. ábra: Ragadós végtermék az Eco RI enzim által
Mi a különbség a Blunt és Sticky End Ligation között?
Blunt vs Sticky End Ligation |
|
| A tompa végű ligálás két tompa végű DNS-fragmens között történik. | A ragadós végű ligálás két egyező, ragadós végű DNS-fragmens között történik. |
| Enzimek | |
| A tompa végű marók tompa végeket eredményeznek. | A ragadós végvágók ragacsos vagy összefüggő végeket eredményeznek. |
| A végek egyezésének követelménye | |
| Nem igényel egyező töredékeket vagy kiegészítő bázisokat. | A végein kiegészítő bázisokra van szükség ahhoz, hogy bázispárokat alkossanak. |
| Hatékonyság | |
| Kevésbé hatékony, mint a ragadós véglekötés | Hatékonyabb, mint a tompa végű lekötés. |
Összefoglaló – tompa vs ragadós végű lekötés
A restrikciós endonukleázok képesek a dsDNS-t hasítani és különböző végű DNS-fragmenseket előállítani. Felismernek bizonyos szekvenciákat, és korlátozzák a DNS-t, ragacsos és tompa végeket hozva létre. A ragadós végeken páratlan alapok találhatók a töredékek végén. A tompa végek az egyenes hasítás miatt jönnek létre, és a végükön bázispárok vannak. A ragadós végű ligáláshoz két komplementer egyszálú DNS-darabra van szükség. A tompa végű lekötés bármely két tompa végfragmens között megtörténik. Ez a különbség a tompa és a ragadós lekötés között.
