Kiemelt különbség – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
A nukleotidok a DNS alapvető szerkezeti egységei és építőkövei. A DNS-molekula egy polinukleotid láncból áll. A DNS-ben négy különböző nukleotid található. Ezek a nukleotidok négy különböző nitrogénbázisból állnak, ezek az A (adenin), G (guanin), C (citozin), T (timin). A DNS-molekulában a nukleotidok sorrendje nagy jelentőséggel bír, mivel fontos genetikai információt kódol az organizmusok növekedéséhez és fejlődéséhez. A DNS-szekvenálás arra a folyamatra utal, amely meghatározza a DNS pontos nukleotidszekvenciáját. Különféle DNS-szekvenálási módszerek léteznek. A Maxam Gilbert-szekvenálás és a Sanger-DNS-szekvenálás a DNS-szekvenálás két módszere, amelyek az első generációs szekvenáláshoz tartoznak. A Maxam Gilbert szekvenálási eljárás meghatározza az alapszekvenciát az 5'-végen jelölt DNS-fragmensek kémiai hasításával, előnyösen a négy nukleotid mindegyikénél, és gélelektroforézissel. A Sanger szekvenálási eljárás az egyszálú DNS szintetizálásával határozza meg a nukleotidszekvenciát DNS polimeráz és didezoxinukleotidok, valamint gélelektroforézis segítségével. Ez a legfontosabb különbség Maxam Gilbert és Sanger Sequencing között.
Mi az a Maxam Gilbert szekvenálás?
A Maxam Gilbert szekvenálás, más néven kémiai szekvenálási módszer, egy olyan technika, amelyet a DNS-ben lévő nukleotidok sorrendjének meghatározására fejlesztettek ki. Ezt a módszert W alter Gilbert és Alan Maxam vezette be 1976-ban, és népszerűvé vált, mivel közvetlenül végrehajtható tisztított DNS-sel. A Maxam Gilbert módszer a DNS szekvenálás első generációjához tartozik, és ez volt az első szekvenálási módszer, amelyet széles körben alkalmaztak a tudósok.
Ennek a módszernek az alapelve a végén jelölt DNS-fragmensek specifikus bázisokon történő korlátozása bázis-specifikus vegyszerekkel és feltételekkel, valamint a jelölt fragmentumok elektroforézissel történő elválasztása a 01. ábrán látható módon. méretükhöz a gélen. Mivel a fragmentumok címkézettek, a DNS-molekula szekvenciája könnyen kikövetkeztethető.
A Maxam Gilbert-módszer bázisspecifikus vegyszereket használ a DNS meghatározott bázisokon történő megtörésére. Két általánosan elterjedt vegyszert, a dimetil-szulfátot és hidrazint használnak a purinok és pirimidinek szelektív támadására.
A Maxam Gilbert szekvenálási módszer több lépésből áll, az alábbiak szerint.
- DNS-szekvencia tisztítása restrikciós endonukleázok segítségével
- A DNS-fragmensek végeinek jelölése radioaktív foszfátok hozzáadásával
- A jelölt fragmentumok tisztítása a nem jelölt fragmentumoktól gélelektroforézissel
- A végén jelölt DNS szétválasztása négy csőbe, és külön kezelés bázisspecifikus vegyszerekkel
- Az egyes csövek tartalmának elektroforézise külön vonalakon gélen, és a fragmentumok hosszuk szerinti szétválasztása.
- A töredékek detektálása autoradiográfiával.
01. ábra: Maxam Gilbert szekvenálás
Mi az a Sanger Sequencing?
A Sanger Sequencing egy szekvenálási módszer, amelyet Frederick Sanger és munkatársai fejlesztettek ki 1977-ben egy adott DNS-fragmens bázisszekvenciájának meghatározására. Láncvégződési szekvenálásnak vagy Dideoxy szekvenálási módszernek is nevezik. Ez a módszer a láncvégző didezoxinukleotidok (ddNTP-k), például ddGTP, ddCTP, ddATP és ddTTP szelektív beépítésének elvén működik a DNS polimeráz által az egyszálú DNS szintézise során a szálképzés leállítása érdekében. A didezoxinukleotidokból hiányoznak a 3’ OH-csoportok a foszfodiészter kötések kialakításához a szomszédos nukleotidokkal. Ezért a szálképződés leáll, amint egy ddNTP beépül az újonnan kialakuló szálba a sanger szekvenálás során.
Ennél a módszernél négy különálló DNS-szintézis reakciót (PCR) hajtanak végre négy különálló csőben, egyfajta ddNTP-vel. A PCR-csövekhez egyéb követelmények is tartoznak, beleértve a primereket, dNTP-ket, Taq polimerázt, specifikus körülményeket stb. Négy külön reakciót hajtanak végre négy csőben négy keverékkel. A PCR-reakciók után a kapott DNS-fragmenseket hővel denaturáljuk és gélelektroforézissel elválasztjuk. Ezután a fragmenseket jelölt (radioaktív vagy fluoreszcens) primer vagy dNTP-k használatával láthatóvá teszik, amint az a 02. ábrán látható.
02. ábra: Sanger szekvenálás
Mi a különbség a Maxam Gilbert és a Sanger Sequencing között?
Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing |
|
| A Maxam Gilbert szekvenálás az első DNS-szekvenálásra kifejlesztett technika. | A Sanger szekvenálási módszert a Maxam Gilbert szekvenálási módszer után vezették be. |
| Használat | |
| Ezt a módszert ritkán használják. | A Sanger szekvenálást rutinszerűen használják a szekvenáláshoz. |
| Veszélyes vegyi anyagok használata | |
| Veszélyes vegyi anyagokat használ. | A veszélyes vegyszerek használata a Maxam Gilbert-módszerhez képest korlátozott. |
| Címkézés az észleléshez | |
| Ez a módszer radioaktív P32-t használ a DNS-fragmensek végeinek jelölésére. | A Sanger szekvenálás radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt ddNTP-ket használ. |
Összefoglaló – Maxam Gilbert vs Sanger Sequencing
A Maxam Gilbert és Sanger szekvenálás kétféle DNS-szekvenálási technika, amelyek az első generációs DNS-szekvenálás alá tartoznak. A Maxam Gilbert-szekvenálás az első módszer, amelyet 1976-ban vezettek be a DNS-szekvenáláshoz, és a végjelölt DNS-fragmensek bázis-specifikus vegyszerekkel történő törésével hajtják végre. Ezért ezt kémiai szekvenálásnak nevezik. A Sanger szekvenálási módszert 1977-ben vezették be, és a ddNTP által vezérelt láncvégződési reakciókon alapul. A Maxam Gilbert módszernél népszerű Sanger szekvenálási módszer a Maxam Gilbert módszer számos hátránya miatt, mint például a túlzott időfelhasználás, veszélyes vegyszerek használata stb. Ez a különbség Maxam Gilbert és Sanger szekvenálás között.
