Kiemelt különbség – NGS vs Sanger Sequencing
Next Generation Sequencing (NGS) és Sanger Sequencing az idők során kifejlesztett kétféle nukleotid szekvenálási technika. A Sanger Sequencing módszert sok éven át széles körben használták, és az NGS nemrég váltotta fel, előnyei miatt. A legfontosabb különbség az NGS és a Sanger Sequencing között az, hogy az NGS azon az elven működik, hogy több millió szekvenciát szekvenál egyidejűleg, gyorsan egy szekvenáló rendszeren keresztül, míg a Sanger Sequencing a láncvégződés elvén működik a didezoxinukleotidok DNS-polimeráz enzim általi szelektív beépítése miatt. a DNS-replikáció és az ebből eredő fragmensek kapilláris elektroforézissel történő elválasztása során.
Mi az a nukleotidszekvenálás?
A genetikai információk egy szervezet DNS-ének vagy RNS-ének nukleotidszekvenciáiban tárolódnak. Egy adott fragmentumban (egy génben, géncsoportban, kromoszómában és teljes genomban) a nukleotidok helyes sorrendjének meghatározását (négy bázis felhasználásával) nukleotidszekvenálásnak nevezzük. A genomikai vizsgálatokban, törvényszéki vizsgálatokban, virológiában, biológiai szisztematikában, orvosi diagnosztikában, biotechnológiában és sok más területen nagyon fontos a gének szerkezetének és működésének elemzése. A tudósok által kifejlesztett különböző típusú szekvenálási módszerek léteznek. Közülük a Frederick Sanger által 1977-ben kifejlesztett Sanger-szekvenálást széles körben használták és népszerűsítették hosszú ideig, amíg a Next Generation Sequencing fel nem váltotta.
Mi az NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) a modern, nagy áteresztőképességű szekvenálási folyamatokra utaló kifejezés. Számos különböző modern szekvenálási technológiát ír le, amelyek forradalmasították a genomikai tanulmányokat és a molekuláris biológiát. Ezek a technikák az Illumina szekvenálás, a Roche 454 szekvenálás, az Ion Proton szekvenálás és a SOLiD (Sequencing by Oligo Ligation Detection) szekvenálás. Az NGS rendszerek gyorsabbak és olcsóbbak. Négy fő DNS-szekvenálási módszert használnak az NGS-rendszerekben; piroszekvenálás, szekvenálás szintézissel, szekvenálás ligációval és ion félvezető szekvenálás. Nagyszámú DNS- vagy RNS-szál (több millió) párhuzamosan szekvenálható. Lehetővé teszi az élőlények teljes genomjának szekvenálását rövid időn belül, ellentétben a Sanger-szekvenálással, amely több időt vesz igénybe.
NGS számos előnnyel rendelkezik a hagyományos Sanger szekvenálási módszerrel szemben. Ez egy nagy sebességű, pontosabb és költséghatékony eljárás, amely kis mintamérettel is végrehajtható. Az NGS használható metagenomikai vizsgálatokban, az egyes genomon belüli inszerciók és deléciók stb. miatti variációk kimutatására, valamint a génexpressziók elemzésére.
1. ábra: Fejlesztések az NGS-szekvenálás terén
Mi az a Sanger Sequencing?
A Sanger Sequencing egy Frederick Sanger és munkatársai által 1977-ben kifejlesztett szekvenálási módszer egy adott DNS-fragmens pontos nukleotidsorrendjének meghatározására. Láncvégződési szekvenciaként vagy dideoxiszekvenciaként is ismert. Ennek a módszernek a működési elve a szálszintézis leállítása láncvégző didezoxinukleotidok (ddNTP-k), például ddGTP, ddCTP, ddATP és ddTTP szelektív beépítésével a DNS-polimeráz által a DNS replikációja során. A normál nukleotidok 3’ OH-csoportokat tartalmaznak a szomszédos nukleotidok közötti foszfodiészter kötés kialakításához a szálképzés folytatásához. A ddNTP-kből azonban hiányzik ez a 3' OH-csoport, és nem képesek foszfodiészter kötéseket kialakítani a nukleotidok között. Ezért a lánc megnyúlása megszűnik.
Ennél a módszernél a szekvenálandó egyszálú DNS az in vitro DNS-szintézis templátszálaként szolgál. További követelmények az oligonukleotid primer, a dezoxinukleotid prekurzorok és a DNS polimeráz enzim. Ha a célfragmens szegélyező végei ismertek, akkor a primerek könnyen megtervezhetők a DNS-replikációhoz. Négy különálló DNS-szintézis reakciót hajtanak végre négy különálló csőben. Minden csőnek külön ddNTP-je van, más követelményekkel együtt. Az adott nukleotidból dNTP-k és ddNTP-k keverékét adjuk hozzá. Hasonlóképpen négy különálló reakciót hajtanak végre négy csőben négy keverékkel. A reakciók után a DNS-fragmensek detektálása és a fragmensmintázat szekvencia információvá való átalakítása történik. A kapott DNS-fragmenseket hővel denaturáljuk és gélelektroforézissel elválasztjuk. Radioaktív nukleotidok alkalmazása esetén a poliakrilamid gél sávos mintázata autoradiográfiával láthatóvá tehető. Ha ez a módszer a fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidokat használja, akkor a gél leolvasása lecsökkenthető, és a fluoreszcens detektor által detektálandó lézersugáron áthaladva. Annak érdekében, hogy elkerüljük azokat a hibákat, amelyek akkor fordulhatnak elő, amikor egy sorozatot a szem beolvas és manuálisan beír a számítógépbe, ezt a módszert a számítógéppel összekapcsolt automata szekvenszer használatára fejlesztették ki.
Ezt a módszert használják a Human Genome projektből származó DNS szekvenálására. Ezt a módszert még mindig használják fejlett módosításokkal, mert pontos sorrendinformációt ad annak ellenére, hogy drága és lassú folyamat.
2. ábra: Sanger szekvenálás
Mi a különbség az NGS és a Sanger Sequencing között?
NGS vs Sanger Sequencing |
|
| Next Generation Sequencing (NGS) a modern, nagy teljesítményű szekvenálási folyamatokra utal. Számos különböző modern szekvenálási technológiát ír le | A Sanger Sequencing egy Frederick Sanger által kifejlesztett szekvenálási módszer egy adott DNS-fragmens pontos nukleotidsorrendjének meghatározására. |
| Költséghatékonyság | |
| Az NGS olcsóbb eljárás, mert csökkenti az időt, az emberi erőt és a vegyszereket. | Ez költséges folyamat, mert időt, embert és több vegyszert igényel. |
| Sebesség | |
| Ez gyorsabb, mivel a kémiai detektálás és számos szál jelérzékelése párhuzamosan történik. | Ez időigényes, mivel a kémiai detektálás és a jelérzékelés két külön folyamatként történik, és egyszerre csak a szálon lehet olvasni. |
| Megbízhatóság | |
| NGS megbízható. | A Sanger szekvenálása kevésbé megbízható |
| Mintaméret | |
| NGS kevesebb DNS-t igényel. | Ez a módszer nagy mennyiségű templát DNS-t igényel. |
| DNS-bázisok szekvenált fragmensenként | |
| A DNS-bázisok száma szekvenált fragmensenként alacsonyabb, mint a Sanger-módszer | A sorozatok generálása hosszabb, mint az NGS-szekvenciák. |
Összefoglaló – NGS vs Sanger Sequencing
Az NGS és a Sanger Sequencing a molekuláris biológiában széles körben használt nukleotid szekvenálási technikák. A Sanger szekvenálás egy korai szekvenálási módszer, amelyet az NGS váltott fel. A fő különbség az NGS és a Sanger Sequencing között az, hogy az NGS nagy sebességű, pontosabb és költséghatékonyabb folyamat, mint a Sanger szekvenálás. Mindkét technika jelentős kitöréseket okozott a genetikában és a biotechnológiában.
