Kulcskülönbség – Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
A DNS-szekvenálás nagyon fontos a DNS-elemzés szempontjából, mivel egy adott DNS-régióban a nukleotidok helyes elrendezésének ismerete sok fontos információt árul el róla. Különféle DNS-szekvenálási módszerek léteznek. A Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing két különböző DNS szekvenálási módszer, amelyet széles körben használnak a molekuláris biológiában. A legfontosabb különbség a Sanger szekvenálás és a piroszekvenálás között az, hogy a Sanger szekvenálás didezoxinukleotidokat használ a DNS szintézisének leállítására a nukleotid szekvencia leolvasásához, míg a piroszekvencia a nukleotidok beépítésével és a komplementer szekvencia szintetizálásával észleli a pirofoszfát felszabadulását a szekvencia pontos sorrendjének leolvasásához.
Mi az a Sanger Sequencing?
A Sanger szekvenálás egy első generációs DNS-szekvenálási módszer, amelyet Frederick Sanger és kollégiumai fejlesztettek ki 1977-ben. Láncvégződési szekvenciaként vagy dideoxiszekvenciaként is ismert, mivel a dideoxinukleotidok (ddNTP-k) általi lánclezáráson alapul. Ezt a módszert széles körben használták több mint 30 évig, amíg ki nem fejlesztették az új generációs szekvenálást (NGS). A Sanger szekvenálási technika lehetővé tette a helyes nukleotidsorrend felfedezését vagy egy adott DNS-fragmens kapcsolódását. A ddNTP-k szelektív beépülésén és a DNS-szintézis leállításán alapul az in vitro DNS-replikáció során. A ddNTP-k egyedülálló tulajdonsága, hogy a 3' OH-csoportok hiánya a szomszédos nukleotidok közötti foszfodiészter kötés kialakulásának folytatása érdekében. Ezért a ddNTP csatlakoztatása után a lánc megnyúlása megszűnik, és attól a ponttól kezdve véget ér. Négy ddNTP-t – ddATP, ddCTP, ddGTP és ddTTP – használnak a Sanger-szekvenálásban. Ezek a nukleotidok leállítják a DNS-replikációs folyamatot, amikor beépülnek a növekvő DNS-szálba, és változó hosszúságú rövid DNS-t eredményeznek. A kapilláris gélelektroforézis segítségével ezeket a rövid DNS-szálakat méretük szerint rendezzük a gélen, ahogy az a 01. ábrán látható.
1. ábra: Szintetizált rövid DNS kapilláris gélelektroforézise
A DNS in vitro replikációjához kevés követelményt kell teljesíteni. Ezek DNS polimeráz enzim, templát DNS, oligonukleotid primerek és dezoxinukleotidok (dNTP). A Sanger-szekvenálás során a DNS-replikációt négy különálló kémcsőben, valamint négyféle ddNTP-vel külön-külön hajtják végre. A dezoxinukleotidokat nem helyettesítik teljesen a megfelelő ddNTP-k. Az adott dNTP keverékét (például dATP + ddATP) a csőbe helyezzük, és megismételjük. Négy külön csőterméket futtatunk gélen négy különálló lyukban. Ezután a gél leolvasásával a szekvencia összeállítható a 02. ábrán látható módon.
02. ábra: Sanger szekvenálás
A Sanger-szekvenálás egy fontos technika, amely a molekuláris biológia számos területén segít. A humán genom projekt sikeresen zárult a Sanger szekvenáláson alapuló módszerek segítségével. A Sanger-szekvenálás hasznos a cél-DNS-szekvenálásban, a rák- és genetikai betegségek kutatásában, a génexpresszió-elemzésben, az emberi azonosításban, a kórokozók kimutatásában, a mikrobiális szekvenálásban stb.
A Sanger-szekvenálásnak számos hátránya van:
- A szekvenálandó DNS hossza nem lehet hosszabb 1000 bázispárnál
- Egyszerre csak egy szál szekvenálható.
- A folyamat időigényes és költséges.
Ezért új, fejlett szekvenálási technikákat fejlesztettek ki idővel a problémák leküzdésére. Mindazonáltal a Sanger-szekvenálást továbbra is használják a rendkívül pontos, körülbelül 850 bázispár hosszúságú töredékek eredményei miatt.
Mi az a piroszekvenálás?
A piroszekvenálás egy új DNS-szekvenálási technika, amely a „szintézissel történő szekvenáláson” alapul. Ez a technika a pirofoszfát felszabadulás kimutatásán alapul a nukleotid beépülése során. A folyamatot négy különböző enzim alkalmazza: DNS-polimeráz, ATP-szulfuriláz, luciferáz és apiráz, valamint két szubsztrát, az adenozin-5'-foszfoszulfát (APS) és a luciferin.
A folyamat a primer megkötésével kezdődik az egyszálú DNS-templáthoz, és a DNS-polimeráz megkezdi a vele komplementer nukleotidok beépülését. Amikor a nukleotidok összekapcsolódnak (nukleinsav polimerizáció), pirofoszfát (két foszfátcsoport összekapcsolódik) csoportok és energia szabadul fel. Minden egyes nukleotid hozzáadása ekvimoláris mennyiségű pirofoszfátot szabadít fel. A pirofoszfát az ATP-szulfuriláz által ATP-vé alakul APS szubsztrát jelenlétében. A keletkezett ATP a luciferáz által közvetített luciferin oxiluciferinné való átalakulását hajtja végre, látható fényt hozva létre olyan mennyiségben, amely arányos az ATP-k mennyiségével. A fényt fotonérzékelő eszköz vagy fotosokszorozó érzékeli, és pirogramot hoz létre. Az apiráz lebontja az ATP-t és a nem beépült dNTP-ket a reakcióelegyben. A dNTP hozzáadása egyszerre történik meg. Mivel a nukleotid hozzáadása a fény beépülése és detektálása szerint ismert, a templát szekvenciája meghatározható. A pirogramot a 03. ábrán látható módon a minta DNS nukleotidszekvenciájának generálására használják.
A piroszekvenálás nagyon fontos az egynukleotidos polimorfizmus analízisében és a DNS rövid szakaszainak szekvenálásában. A nagy pontosság, a rugalmasság, az egyszerű automatizálás és a párhuzamos feldolgozás a piroszekvenálás előnyei a Sanger szekvenálási technikákkal szemben.
03. ábra: Piroszekvenálás
Mi a különbség a Sanger Sequencing és a Pyrosequencing között?
Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing |
|
| A Sanger szekvenálás egy DNS-szekvenálási módszer, amely a ddNTP-k szelektív beépülésén alapul DNS polimerázzal és láncvégződéssel. | A piroszekvenálás egy DNS-szekvenálási módszer, amely a nukleotid beépülése során felszabaduló pirofoszfát kimutatásán alapul. |
| A ddNTP használata | |
| ddNTP-k a DNS-replikáció leállítására szolgálnak | ddNTP-k nincsenek használatban. |
| Enzimek érintettek | |
| DNS polimerázt használnak. | Négy enzimet használnak: DNS-polimerázt, ATP-szulfurilázt, luciferázt és apirázt. |
| Használt szubsztrátok | |
| Az APS és a Luciferin nem használatos. | Adenozin 5’-foszfoszulfátot (APS) és luciferint használnak. |
| Maximális hőmérséklet | |
| Ez egy lassú folyamat. | Ez egy gyors folyamat. |
Összefoglaló – Sanger szekvenálás vs Pyrosequencing
A Sanger szekvenálás és a Pyrosequencing a molekuláris biológiában használt két DNS szekvenálási módszer. A Sanger szekvenálás a nukleotidok sorrendjét a lánc meghosszabbításának befejezésével állítja össze, míg a piroszekvenálás a nukleotidok pontos sorrendjét a nukleotidok beépítésével és a pirofoszfátok felszabadulásának detektálásával állítja össze. Ezért a fő különbség a Sanger-szekvenálás és a piroszekvenálás között az, hogy a Sanger-szekvenálás a láncvégződéssel, míg a piroszekvencia a szintézissel történő szekvenáláson dolgozik.
