A legfontosabb különbség a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között a viselkedésmódjukban rejlik. A klónozás klónozási szekvenálási módszere magában foglalja a kromoszómák feltérképezését és a szekvenálás előtti klónozást, míg a shotgun szekvenálás során mind a kromoszómatérképezési, mind a klónozási lépéseket kihagyja a szekvenálás során.
Klónozás klón szekvenálással és klónozás shotgun szekvenálással a modern kori genomszekvenálás két módszere. A klónozás klónnal történő szekvenálás megbízhatóbb módszer a szekvenálásra. A shotgun szekvenálásos klónozási módszer azonban gyorsabb és olcsóbb. A cikk a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás közötti finom különbségre összpontosít.
Mi az a klónonkénti szekvenálás?
A klónozás klónozással a genomszekvenálás egyik módszere. Ez megköveteli az egyes kromoszómák feltérképezését a DNS felosztása előtt. A feltérképezés után a DNS-t 150 kilobázis hosszúságú fragmentumokra kell bontani. Ezek a fragmentumok ezután készen állnak a szekvenálásra. A következő lépés a DNS-fragmensek beépítése a bakteriális mesterséges kromoszómákba (BAC), majd a baktériumsejtekbe. Mivel a fragmentumok most a baktériumsejtek belsejében vannak, minden alkalommal, amikor a baktériumok osztódnak, a beépített DNS-fragmensek is osztódnak, és sok azonos másolatot készítenek. Ezután az egyedi bakteriális klón-DNS-t 500 bázispár hosszúságú fragmensekre fragmentálják. Kisebb és egymást átfedő töredékek. Ezután a szekvenálás úgy történik, hogy ezeket a fragmentumokat egy ismert DNS-szekvenciával rendelkező vektorba inszertáljuk. A vektor ismert szekvenciájából kiindulva a szekvenálás az ismeretlen szekvenciáig folytatódik.
A szekvenálás befejezése után azonosítani kell az átfedő szekvenciák területeit. Ezt követően a fragmensek összekapcsolása megtörténik, hogy a kezdetben a BAC-kban bemutatott nagyobb fragmentumokat képezzék. Ezután a nagyobb fragmentumok kromoszómába való összeillesztése a genomtérkép szerint történik.
01. ábra: Klónozás klónonkénti sorrendben
A klónozással történő klónozás jelentős előnye, hogy az előre elkészített genomtérkép segít a nagyobb fragmentumok megbízható összeállításában. Ennek a szekvenálási módszernek azonban az a hátránya, hogy időigényes a genomtérképek előállítása és a klónok készítése. A „Human Genome Project” során azonban ezt a módszert részesítették előnyben.
Mi az a Clone by Shotgun Sequencing?
A shotgun szekvenálás segítségével történő klónozás egy olyan szekvenálási módszer, amely a DNS-szekvenciákat véletlenszerűen sok kis fragmentumra bontja, és az átfedő régiók megfigyelésével újra összeállítja a szekvenciát. A nagyobb emlős genomokat nehéz klónozni és összeállítani. Ez a szerkezeti összetettségüknek és méretüknek köszönhető. Annak ellenére, hogy a klón a klón szekvenálási módszerrel megbízható, az összetett szervezetek genomjainak szekvenálása hosszú időt vesz igénybe. Ezért a shotgun szekvenálás segítségével történő klónozás megbízható, olcsóbb, gyorsabban végrehajtható szekvenálási módszerré vált. Ezért a modern kor tudósai erre a szekvenálási módszerre támaszkodnak az összetett genomok leküzdésére.
02. ábra: Klónozás Shotgun Sequencing segítségével
A shotgun szekvenálási módszerrel végzett klónozás során nem történik hagyományos genomtérképezési és klónozási lépés. Kezdetben a teljes genom 20 kilobázistól 300 kilobázisig terjedő méretűre töredezett. Ezután sorba rendezés történik. Ezután kifinomult számítógépes szoftverrel össze kell állítani a töredékeket az átfedő régiók alapján.
A shotgun szekvenálás segítségével történő klónozás segít javítani a meglévő genomszekvenciák pontosságát. Ennek a módszernek az a fő előnye, hogy sokkal gyorsabb és olcsóbb, mint a klónozás klón szekvenálási módszer. Ez a folyamat azonban nem foglalja magában a genetikai térkép használatát. Ezért nagyobb valószínűséggel fordulnak elő hibák az összeszerelés során. Így ez komoly hátrányt jelent a shotgun szekvenálási módszerrel végzett klónozás során.
Milyen hasonlóságok vannak a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között?
- Mind a klónozás klónszekvenálással, mind a shotgun szekvenálás a genomszekvenálás két módszere.
- Mindkét szekvenálási technika során a lebontott töredékek összeállítása az átfedő régiók azonosításával történik.
- A DNS kisebb fragmentumokra való lebontása is szükséges mind a klónok, mind a shotgun szekvenáláshoz.
Mi a különbség a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között?
A klónozás klónnal történő szekvenálási technikával két fő lépésből áll: a kromoszómák feltérképezéséből és a klónozásból. Ezzel szemben a shotgun szekvenálással történő klónozás nem követi ezt a két lépést; véletlenszerűen sok kis fragmentumra bontja a DNS-szekvenciákat, és az átfedő régiók megfigyelésével újra összeállítja a szekvenciát. Ezért ez a legfontosabb különbség a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között. Ennek a tényezőnek köszönhetően a klónonkénti szekvenálás költséges és időigényes folyamat, míg a shotgun segítségével történő klónozás gyorsabb és olcsóbb.
Azonban az összeállítás közbeni hibák kisebb valószínűséggel fordulnak elő klónozással klónozással. Ezért nagy a megbízhatósága. A sörétes szekvenálással történő klónozás azonban viszonylag kevésbé megbízható technika. Tehát ez is jelentős különbség a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között.
Az alábbi infografika további információkat mutat be a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás közötti különbségről.
Összefoglaló – Klónonkénti szekvenálás vs Shotgun szekvenálás
A klón szekvenálás és a shotgun szekvenálás közötti különbséget összefoglalva a klón szekvenálás és a shotgun szekvenálás a genomszekvenálás két módszere. A klónozás klón szekvenálási technikával azonban magában foglalja a genomtérképezést és a klónozási folyamatokat is, míg a shotgun szekvenálással végzett klónozás nem. Tehát ez a legfontosabb különbség a klónonkénti szekvenálás és a shotgun szekvenálás között. Mivel a genom-térképezés a klónozás során, klónszekvenálással történik, a hibák kisebb valószínűséggel fordulnak elő a szekvenciák összeállítása során. A sörétes szekvenálással történő klónozás azonban sokkal gyorsabb és olcsóbb folyamat. Ennek ellenére viszonylag kevésbé megbízható. A „Human Genome Project” során a klónozás klónnal történő szekvenálás volt az előnyben részesített szekvenálási módszer. A modern kori molekuláris biológus azonban inkább a sörétes szekvenálással végzett klónokra támaszkodik.
