Kulcs különbség – PCR vs DNS szekvenálás
A PCR és a DNS-szekvenálás két fontos technika a molekuláris biológiában. A polimeráz láncreakció (PCR) az a folyamat, amely egy DNS-fragmens nagyszámú másolatát hoz létre. A DNS-szekvenálás az a technika, amely egy adott DNS-fragmens nukleotidjainak pontos sorrendjét eredményezi. Ez a legfontosabb különbség a PCR és a DNS szekvenálás között. A PCR a DNS-szekvenálás egyik fő lépése.
Mi az a PCR?
A polimeráz láncreakció (PCR) egy DNS-amplifikációs technika, amelyet a molekuláris biológiában használnak. Egy adott DNS-fragmens több ezer-millió másolatát állítja elő. Ezt a módszert Kary Mullis fejlesztette ki 1983-ban. Ennél a technikánál az amplifikálandó DNS-fragmens szolgál templátként, és a DNS-polimeráz enzim komplementer nukleotidokat ad a primerhez, amely elérhető a PCR-elegyben. A PCR-reakció végén a minta DNS-ének sok másolata szintetizálódik.
A PCR keverék különböző összetevőiből áll, beleértve a DNS-t, a DNS-polimerázt (Taq-polimeráz), a primereket (forward és a reverse primerek), a nukleotidokat (a DNS építőköveit) és a puffert. A PCR egy PCR gépen belül történik, és a megfelelő PCR keveréket kell betölteni a gépbe, és a megfelelő programot kell futtatni. Ez a technika lehetővé teszi, hogy nagyon kis mennyiségű DNS-ből több ezer-millió másolatot készítsenek egy adott DNS-szakaszról.
A PCR-reakciók ciklikus módon mennek végbe, hogy a gélen látható mennyiségű PCR-terméket állítsanak elő. A PCR-reakciónak három fő lépése van, nevezetesen a denaturáció, a primer összekapcsolása és a szál kiterjesztése, amint az a 01. ábrán látható. Ez a három lépés három különböző hőmérsékleten megy végbe. A DNS kétszálú formában létezik a komplementer bázisok közötti hidrogénkötések révén. Az implikáció előtt a kétszálú DNS-t el kell választani egymástól. Magas hőmérséklet adásával történik. Magas hőmérsékleten a kétszálú DNS egyszálúvá denaturálódik. Ezután a primereknek közelebb kell kerülniük a specifikus fragmentum vagy a DNS génjének határoló végeihez. A primer egy egyszálú DNS egy rövid darabja, amely komplementer a célszekvenciával. A forward és a reverse primerek a denaturált minta DNS határoló végein lévő komplementer bázisokkal kapcsolódnak össze az összekapcsolási hőmérsékleten. Az alapozóknak hőállónak kell lenniük. Miután a primerek összekapcsolódnak a DNS-mintával, a taq polimeráz enzim elindítja az új szálak szintézisét a cél-DNS-sel komplementer nukleotidok hozzáadásával. A Taq polimeráz egy hőstabil enzim, amelyet a Thermus aquaticus nevű termofil baktériumból izolálnak. A PCR puffer fenntartja az optimális feltételeket a taq polimeráz működéséhez. A PCR-reakciók e három szakaszát megismételjük a szükséges mennyiségű PCR-termék előállításához. Minden PCR-reakció után a DNS-kópia számát megkétszerezzük. Ezért a PCR-ben exponenciális amplifikáció figyelhető meg. A PCR termékek gélelektroforézissel megfigyelhetők, és további vizsgálatokhoz megtisztíthatók.
01. ábra: A PCR-reakció főbb lépései
A PCR értékes eszköz az orvosi és biológiai kutatásokban. A PCR különleges értéket képvisel a törvényszéki tudományban, mivel képes felerősíteni a DNS-t a bűnözők apró mintáiból végzett vizsgálatokhoz, és kriminalisztikai DNS-profilokat készíteni. A PCR-t széles körben használják a molekuláris biológia számos területén, beleértve a genotipizálást, a génklónozást, a mutációk kimutatását, a DNS-szekvenálást, a DNS-microarray-eket és az apasági vizsgálatot stb.
02. ábra: Polimeráz láncreakció
Mi az a DNS-szekvenálás?
A DNS-szekvenálás a nukleotidok – adenin, guanin, citozin és timin – pontos sorrendjének meghatározása egy adott DNS-fragmensben. A genetikai információkat a DNS-szekvenciák a nukleotidok helyes sorrendjében tárolják. Ezért a nukleotidok pontos sorrendjének megtalálása egy DNS-fragmensben nagyon fontos, hogy ismerjük a gének szerkezetét és működését.
A DNS szekvenálási protokoll különböző folyamatokat foglal magában. Az első lépés egy szervezet érdekelt DNS-ének vagy genomiális DNS-ének izolálása. PCR-rel (a fent leírtak szerint) a DNS kívánt régióját fel kell amplifikálni. Az amplifikált PCR terméket gélelektroforézissel el kell választani és meg kell tisztítani. Az amplifikált fragmenseket szekvenálási templátként szolgálják fel. A szekvenálás történhet Sanger szekvenálás vagy nagy áteresztőképességű szekvenálási módszer szerint. A Sanger-szekvenálás a kapott DNS-fragmensek kapilláris elektroforézisét igényli. A helyes nukleotidsorrend meghatározása történhet autoradiográfiák kézi leolvasásával vagy automatizált DNS-szekvenátorok használatával.
A génszekvenálás hozzájárult az emberi genom projekthez, és elősegítette az emberi genom feltérképezését 2003-ban. A kriminalisztika területén a DNS-szekvenálás lehetővé tette az egyedi DNS-szekvenciát mutató egyének azonosítását és a bűnözők azonosítását. Az orvostudományban a DNS-szekvenálás segítségével kimutathatóak a genetikai és egyéb betegségekért felelős gének, megtalálják a hibás géneket és helyettesíthetők megfelelő génekkel. A mezőgazdaságban egyes mikroorganizmusok DNS-szekvenálási információit használják fel gazdaságilag kívánt tulajdonságokkal rendelkező transzgénikus növények előállítására.
03. ábra: DNS-szekvenálás
Mi a különbség a PCR és a DNS-szekvenálás között?
PCR kontra DNS-szekvenálás |
|
| A PCR-eljárás több ezer vagy több millió másolatot hoz létre az érdekelt DNS-fragmensből. | A DNS-szekvenálás az a folyamat, amely során meghatározzuk a nukleotidok pontos sorrendjét egy adott DNS-fragmensben. |
| Eredmény | |
| A PCR több ezer-millió másolatot hoz létre egy adott DNS-fragmensről | Ez a bázisok megfelelő sorrendjét eredményezi egy adott DNS-fragmensben. |
| ddNTP-k bevonása | |
| A PCR nem igényel ddNTP-ket. dNTP-ket használ. | A DNS-szekvenáláshoz ddNTP-kre van szükség a szálképződés leállításához. |
Összefoglaló – PCR kontra DNS szekvenálás
A PCR és a DNS-szekvenálás nagyon fontos eszközök a molekuláris biológia számos területén. A DNS-fragmensek amplifikálása PCR-technikával történik, míg a DNS-fragmens nukleotidjainak helyes sorrendjét a DNS-szekvenálás határozza meg. Ez a különbség a PCR és a DNS szekvenálás között.
