A legfontosabb különbség a Golden Gate és a Gibson Assembly között az, hogy a Golden Gate egy adott klónozandó szekvencián belül restrikciós helyek jelenlétére támaszkodik, míg a Gibson Assembly nem egy adott szekvencián belüli restrikciós helyek jelenlétére támaszkodik. klónozni kell.
Az elmúlt évtizedekben a molekuláris tudósok különféle szabványosított eljárásokat fejlesztettek ki, amelyek lehetővé teszik több DNS-fragmens egyszerűbb összeállítását egyetlen darabká. Ezért az olyan klónozási módszereket, mint a restrikciós enzim ligálás, az átjáró klónozás, a Gibson-összeállítás, a Golden Gate-összeállítás és a TOPO klónozás, széles körben alkalmazzák a kutatók tudományos kísérleteik során. Ezért a Golden Gate és a Gibson Assembly két olyan molekuláris klónozási módszer, amelyek lehetővé teszik több DNS-fragmens egyetlen darabká történő összeállítását.
Mi az a Golden Gate Assembly?
A Golden Gate egy molekuláris klónozási módszer, amely megkönnyíti több DNS-fragmens egyetlen darabká történő összeállítását. Ez a módszer restrikciós helyek jelenlétén alapul egy adott klónozandó szekvencián belül. 1996-ból származik. Ez a technika IIS típusú restrikciós enzimeket és T4 DNS-ligázt használ. Ezek az enzimek elvágják a DNS-t a felismerési helyeken kívül. Nem palindromikus túlnyúlásokat hozhatnak létre. Ezért több DNS-fragmens is összeállítható túlnyúló szekvenciák kombinációival.
01. ábra: Golden Gate
Golden Gate összeszerelési eljárás
Golden Gate technikának három fő lépése van:
- túlnyúlások létrehozása a klónozó vektorban,
- több DNS-inszert összeállítása fragmentum-specifikus szekvenciák alkalmazásával a túlnyúlásokon, és
- lekötés.
A Golden Gate összeállítás körkörös klónozó vektorokat (célvektor) használ. Továbbá ennél az eljárásnál a restrikciós helyet eltávolítjuk a ligált termékből, hogy az emésztést és a ligálást egyidejűleg végezzük. A Golden Gate tipikus hőciklus-protokollja 37 °C és 16 °C között oszcillál, mivel a restrikciós enzimek számára a 37 °C, a ligázok számára pedig a 16 °C az optimális.
Mi az a Gibson Assembly?
A Gibson Assembly egy olyan molekuláris klónozási módszer, amely lehetővé teszi több DNS-fragmens egyetlen darabká történő összeállítását. A Golden Gate módszertől eltérően ez a módszer nem támaszkodik restrikciós helyek jelenlétére egy adott klónozandó szekvencián belül. Daniel G. Gibson találta meg, a J. Craig Venter Intézet munkatársa. Ez a technika egy szekvencia- és ligáz-független klónozási (SLIC) módszer.
02. ábra: Gibson-szerelvény
Gibson összeszerelési eljárása
A Gibson Assemblynek olyan DNS-fragmensekre van szüksége, amelyek 20-40 bázispárt tartalmaznak, átfedésben a szomszédos DNS-fragmensekkel. Az átfedések hozzáadása PCR-rel történik. Ezután ezeket a DNS-fragmenseket hozzáadjuk a három enzimet tartalmazó Gibson-maser keverékhez. Ezt az eljárást izoterm körülmények között (50 °C-on 1 órán át) végezzük három különböző enzim felhasználásával: exonukleáz, DNS-polimeráz és DNS-ligáz. Az exonukleáz visszarágja a DNS-t az 5’-végről. Így nem gátolja a polimeráz aktivitást, és lehetővé teszi, hogy a reakció egyetlen folyamatban lejátszódjon. Az így létrejövő egyszálú régiók a szomszédos DNS-fragmenseken egymáshoz kapcsolhatók az átfedő szekvenciák miatt. A DNS-polimeráz nukleotidok hozzáadásával pótolja a hézagokat. Végül a DNS-ligáz kovalensen csatlakozik a szomszédos szegmensek DNS-éhez. Általában a Gibson Assembly linearizált célvektorokat használ. Ezen túlmenően ezzel a módszerrel egyidejűleg akár 15 DNS-fragmens is kombinálható a szekvencia-hasonlóság alapján.
Hasonlóságok a Golden Gate és a Gibson Assembly között
- Golden Gate és Gibson Assembly két molekuláris klónozási módszer.
- Mindkét módszer több DNS-fragmentumot képes egyetlen darabká összeállítani.
- Ezek a módszerek célvektorokat használnak.
- Mindkét módszer termikus ciklusokat használ több DNS-fragmens összeállítására.
- Helyspecifikus mutagenezisben használják őket.
Különbség a Golden Gate és a Gibson Assembly között
A Golden Gate egy molekuláris klónozási módszer, amelyet több DNS-fragmens egyetlen darabká történő összeállítására használnak, és egy adott klónozandó szekvencián belüli restrikciós helyek jelenlétén alapul, míg a Gibson Assembly egy molekuláris klónozási módszer, amelyet a több DNS-fragmens összeállítása egyetlen darabká anélkül, hogy egy adott klónozandó szekvencián belül restrikciós helyek jelenlétére támaszkodnánk. Ez a legfontosabb különbség a Golden Gate és a Gibson Assembly között. Ezenkívül a Golden Gate módszer körkörös célvektort, míg a Gibson Assembly módszer linearizált célvektort használ.
A következő infografika a Golden Gate és a Gibson Assembly közötti különbséget mutatja be.
Összefoglaló – Golden Gate vs Gibson Assembly
A molekuláris klónozás egy olyan módszer, amellyel rekombináns DNS-molekulákat állítanak össze, és replikációjukat irányítják a gazdaszervezeteken belül. A Golden Gate és a Gibson Assembly két olyan molekuláris klónozási módszer, amelyek lehetővé teszik több DNS-fragmens egyetlen darabká történő összeállítását. A Golden Gate módszer egy adott klónozandó szekvencián belüli restrikciós helyek jelenlétére támaszkodik, míg a Gibson Assembly nem egy adott klónozandó szekvencián belüli restrikciós helyek jelenlétére támaszkodik. Így ez a legfontosabb különbség a Golden Gate és a Gibson Assembly között.
