A fő különbség a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok között az, hogy a hagyományos PCR egy olyan technika, amelyet a DNS specifikus szekvenciáinak amplifikálására fejlesztettek ki, a beágyazott PCR pedig a hagyományos PCR olyan módosítása, amely két egymást követő amplifikációs reakcióból áll, míg a valódi. Az -time PCR a hagyományos PCR egy változata, amely képes az amplifikált termék mennyiségi meghatározására.
A PCR egy nagyon elterjedt tudományos technika, amelyet széles körben használnak a kutatásban és az orvostudományban DNS kimutatására. A PCR-teszteket az antigének kimutatására használják DNS-ük vagy RNS-ük kimutatásával. Általában a vírus RNS jelen van a szervezetben, mielőtt antitesteket észlelne vagy a betegség tüneteit mutatná. A PCR-teszt meg tudja állapítani, hogy valaki korán megfertőződött-e vagy sem. Jelenleg a PCR a standard teszt a COVID-19 betegség kimutatására. Különféle típusú PCR-technikák léteznek, mint például a valós idejű PCR, a beágyazott PCR, a multiplex PCR, a hot start PCR és a hosszú távú PCR stb.
Mik azok a hagyományos PCR-vizsgálatok?
A hagyományos PCR vizsgálat egy in vitro DNS-amplifikációs technika, amelyet rutinszerűen végeznek molekuláris biológiai laboratóriumokban. Ez a módszer lehetővé tette egy adott DNS-fragmens több ezer-millió másolatának előállítását. Kary Mullis 1980-ban vezette be ezt a technikát. Ehhez a technikához egy templátként ismert DNS-fragmensre van szükség ahhoz, hogy sok másolatot lehessen készíteni róla. A Taq polimeráz DNS polimeráz enzimként működik, és katalizálja a templát szekvencia új szálainak szintézisét.
A PCR-elegyben lévő primerek a fragmens kiterjesztések kiindulópontjaként működnek. A DNS-másolatok készítéséhez szükséges összes összetevő megtalálható a PCR-elegyben. A PCR-reakciót PCR-gépben futtatják, és a megfelelő PCR-keverékkel és a megfelelő PCR-programmal kell táplálni. Ha a reakcióelegy és a program megfelelő, akkor nagyon kis mennyiségű DNS-ből előállítja a szükséges számú másolatot egy adott DNS-szakaszról.
01. ábra: Hagyományos PCR-vizsgálat
A PCR-reakciónak három fő lépése van: denaturáció, primer annealing és szálhosszabbítás. Ez a három lépés három különböző hőmérsékleten megy végbe. A PCR puffer fenntartja az optimális feltételeket a Taq polimeráz működéséhez. A PCR-reakció e három szakaszát megismételjük a szükséges mennyiségű PCR-termék előállításához. Minden PCR-reakciónál a DNS-kópiák száma megduplázódik. Ezért a PCR-ben exponenciális amplifikáció figyelhető meg. A PCR termék gélelektroforézissel rezolválható, mivel látható mennyiségű DNS-t termel a gélen, és további vizsgálatokhoz, például szekvenáláshoz tisztítható.
A PCR értékes eszköz az orvosi és biológiai kutatásokban. A PCR-nek különösen a törvényszéki vizsgálatokban van óriási értéke, mivel képes felerősíteni a DNS-t a bűnözők apró mintáiból végzett vizsgálatokhoz, és kriminalisztikai DNS-profilokat készíteni. A PCR-t széles körben használják a molekuláris biológia számos területén, beleértve a genotipizálást, a génklónozást, a mutációk kimutatását, a DNS-szekvenálást, a DNS-microarray-eket és az apasági vizsgálatot.
Mik azok a beágyazott PCR-vizsgálatok?
A Nested PCR a PCR egy olyan típusa, amely csökkenti a DNS nem specifikus amplifikációját. Két egymást követő PCR vagy két egymást követő amplifikációs reakció van a beágyazott PCR vizsgálatban. Az első amplifikációs reakció során PCR-termék keletkezik. Az első reakció után egy második amplifikációs reakciót hajtunk végre az első reakció PCR-termékén. Ezért a második reakcióelegyben lévő primerek kötődnek az első PCR-termékhez és amplifikálják azt.
02. ábra: Beágyazott PCR
A primer párok minden reakcióban eltérőek. A primerek nem specifikus kötődése a beágyazott PCR-ben csökken. A beágyazott PCR vizsgálatok hasznosak az érzékenység és/vagy specifitás növelésére. Azonban a beágyazott PCR ismereteket igényel az érdeklődő szekvenciáról.
Mik azok a valós idejű PCR-vizsgálatok?
A valós idejű PCR vagy kvantitatív PCR (Q PCR) a PCR módosított változata, amely kvantitatívan méri a PCR-termékeket. Ezért ez a technika valós időben számszerűsíti az amplifikációt egy valós idejű PCR-gép segítségével. Alkalmas módszer a mintában jelenlévő célszekvencia vagy gén mennyiségének meghatározására is.
A valós idejű PCR érdekessége, hogy egyetlen lépésben egyesíti az amplifikációt és a valódi kvantifikációt. Ezért a kimutatáshoz szükséges gélelektroforézis kiküszöbölhető a valós idejű PCR technikával. A fluoreszcens festékek használata a PCR-termékek jelölésére a PCR-reakciók során végül közvetlen mennyiségi meghatározáshoz vezet. A PCR-termékek felhalmozásakor a fluoreszcens jelek is felhalmozódnak, és ezeket a valós idejű gép méri. A SYBR Green és a Taqman két módszer a valós idejű PCR amplifikációs folyamatának észlelésére vagy figyelésére. Mindkét módszer figyeli az erősítési folyamat előrehaladását, és valós időben jelenti a termék mennyiségét.
03. ábra: Valós idejű PCR
A valós idejű PCR számos alkalmazási területtel rendelkezik, mint például a génexpresszió mennyiségi meghatározása, a mikroRNS és a nem kódoló RNS elemzése, az SNP genotipizálás, a kópiaszám-változatok kimutatása, a ritka mutációk kimutatása, a genetikailag módosított szervezetek kimutatása, és fertőző ágensek kimutatása.
Milyen hasonlóságok vannak a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok között?
- A beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok a hagyományos PCR-vizsgálat módosításai.
- Mindhárom technika DNS-mintákat amplifikál.
- Termékeik szekvenáláshoz vagy elemzéshez használhatók.
- Ezek a vizsgálatok primereket igényelnek.
Mi a különbség a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok között?
A hagyományos PCR egy olyan technika, amelyet bizonyos DNS-szekvenciák amplifikálására fejlesztettek ki. Eközben a Nested PCR a hagyományos PCR módosítása, amely két egymást követő amplifikációs reakcióból áll, a valós idejű PCR pedig a hagyományos PCR olyan változata, amely képes az amplifikált termék mennyiségi meghatározására. Tehát ez a legfontosabb különbség a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok között. A hagyományos és valós idejű PCR-rel ellentétben a beágyazott PCR két primerkészletet használ. Ezenkívül két egymást követő amplifikációs reakció van a beágyazott PCR-ben a nem specifikus amplifikáció csökkentése érdekében. emellett a hagyományos és a valós idejű PCR vizsgálatok nem tartalmaznak két egymást követő amplifikációs reakciót.
A következő infografika táblázatos formában sorolja fel a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok közötti különbségeket az egymás melletti összehasonlítás érdekében.
Összefoglaló – Hagyományos vs egymásba ágyazott vs valós idejű PCR-vizsgálatok
A hagyományos PCR az első technika, amelyet specifikus DNS-fragmensek amplifikálására fejlesztettek ki. A beágyazott PCR és a valós idejű PCR a hagyományos PCR két változata. Két szekvenciális amplifikációs reakció van, és két primer készletet használnak a beágyazott PCR-ben. A valós idejű PCR-t az amplifikált PCR-termék mennyiségi meghatározására fejlesztették ki. Így ez összefoglalja a különbséget a hagyományos beágyazott és valós idejű PCR-vizsgálatok között.
