Kulcs különbség – SDS-oldal vs natív oldal
Az SDS és a natív oldal a molekuláris biológiában használt poliakrilamid gélelektroforézis két típusa. A legfontosabb különbség az SDS oldal és a natív oldal között a használt poliakrilamid gél típusa. Az SDS oldalon denaturáló gélt használnak, ezért a molekulákat molekulatömegük alapján választják el. Ezzel szemben a Native Page-ben nem denaturáló géleket használnak. Ezért a molekulákat méretük, töltésük és alakjuk alapján választják el.
A poliakrilamid gélelektroforézis (Oldal) akrilamid monomerek metilén-bizakrilamiddal történő polimerizálásával készült gélt használ. A poliakrilamid szívósabb és hőstabilabb, mint az agaróz. A poliakrilamid gélek kisebb pórusmérettel rendelkeznek, ami lehetővé teszi a fehérjék hatékony szétválasztását. Az oldalbeállításoknak két fő típusa van, mégpedig az SDS-oldal és a natív oldal. Az SDS Page vagy nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis a fehérjéket molekulatömegük alapján választja el. Az SDS oldalon denaturáló géleket használnak. A Native Page nem denaturáló géleket használ, és a fehérjéket méretük, töltésük és alakjuk (3D konformáció) alapján választja el.
Mi az az SDS-oldal?
Az SDS oldal a leggyakoribb elektroforetikus technika, amelyet a fehérjék molekulatömegük alapján történő elkülönítésére használnak. A gél SDS (nátrium-dodecil-szulfát) hozzáadásával készül, amely mosószer. Az SDS a fehérjéket monomerekké alakítja. Az SDS egy anionos mosószer. Ezért nettó negatív töltést ad a fehérjéknek széles pH-tartományon belül. Amikor a nettó negatív töltés a fehérjemolekulákra kerül, a töltésváltozás következtében a komplex struktúrák felbomlanak. A negatív töltés miatt a fehérjék a pozitív vég felé vonzódnak. Így a kisebb molekulatömegű molekulák gyorsabban haladnak a gélmátrixon, és az anód közelében figyelhetők meg, míg a nagyobb molekulatömegű fehérjék a lyukakhoz közelebb.
01. ábra: SDS-oldal
A polipeptidlánchoz való SDS kötődés arányos annak relatív molekulatömegével. Ezért a molekulatömeg az SDS-oldalon keresztül is meghatározható. Az SDS Page gélek festése brómfenolkék festéssel történik. Az SDS oldal alkalmazásai kiterjedtebbek, ahol felhasználható a relatív molekulatömeg becslésére és a fehérjék relatív mennyiségének meghatározására egy fehérjekeverékben. Az SDS Page a fehérjék keverékében a fehérjeeloszlás meghatározására is használható. Az SDS old alt fehérjék tisztítására és értékelésére is alkalmazzák. A Western blottolás és hibridizáció előzetes eljárásaként használják, amelyet viszont fehérjetérképezésre és azonosításra használnak.
Mi az a natív oldal?
Natív poliakrilamid gél elektroforézis (Native Page) nem denaturáló gélt használ. Ezért SDS-t vagy más denaturálószert nem adnak a gélmátrixhoz. A Native Page-ben a fehérjék szétválasztása a fehérje töltésén és méretén alapul. Ezért a fehérje mobilitása a töltéstől és a fehérje méretétől függ.
A fehérje töltése az aminosavak oldalláncától függ. Ha az oldalláncok negatív töltésűek, a fehérje általános negatív töltést kap, és fordítva. A fehérjék megtartják a 3D-s konformációt a végbemenő hajtogatás miatt. A hajtogatás a fehérjékben található számos kötéstípusból ered, mint például a diszulfidkötések, a hidrofób kölcsönhatások és a hidrogénkötések. Ezért, ha a natív old alt semleges pH-n hordozzák, a fehérjék a fehérje molekula alakja szerint különülnek el. Ezért a Native Page érzékeny technikaként használható a fehérje töltés- vagy konformációváltozásának kimutatására.
A natív oldal fő előnye, hogy az oldalelemzéshez használt fehérje az oldalelemzés után az eredeti állapotában visszanyerhető, mivel a fehérje nem károsodik a folyamat során. A natív oldal viszonylag nagy áteresztőképességű technika, és a fehérje stabilitása megnő.
02. ábra: Natív oldal
A gél futtatása után a Native Page gélt meg lehet tekinteni brómfenol kékkel vagy bármely más megfelelő festőreagenssel történő festéssel. A Native Page alkalmazásai magukban foglalják a savas fehérjék elválasztását, beleértve a glikoproteineket, például a humán rekombináns eritropoetint, vagy a szarvasmarha-szérumalbuminban (BSA) jelenlévő fehérjék azonosítását.
Mi a hasonlóság az SDS-oldal és a natív oldal között?
- Mind az SDS Page, mind a Native Page rendszerek poliakrilamid gélt használnak a gél mátrixaként.
- Mindkettőt fehérjék elkülönítésére és azonosítására használják.
- Mindkettő elektroforetikus mobilitást használ a vegyületek szétválasztására.
- Mindkettő elvégezhető függőlegesen vagy vízszintesen (leginkább függőleges oldalbeállításként, mert a futás hossza hosszabb).
- Mindkét technika működéséhez szükséges az elektroforézis készülék, beleértve a géltartályt, fésűket és a tápegységet.
- A gél vizualizálása festési módszerekkel mindkét technikában elvégezhető.
Mi a különbség az SDS-oldal és a natív oldal között?
SDS oldal kontra natív oldal |
|
| SDS oldal vagy nátrium-dodecil-szulfát oldal a fehérjéket molekulatömegük alapján választja el, és denaturáló gélt használ. | A Native Page nem denaturáló géleket használ, és a fehérjéket méretük, töltésük és alakjuk (3D konformáció) alapján választja el. |
| Gél típusa | |
| Denaturáló gélt használnak az SDS-oldalon. | A natív oldalon nem denaturáló gélt használnak. |
| SDS jelenléte | |
| Az SDS detergensként van jelen, hogy negatív töltést hozzon a mintára az SDS oldalon. | SDS nem található a natív oldalon. |
| Az elválasztás alapja | |
| A fehérjék elválasztása a fehérje molekulatömegétől függ az SDS oldalon. | Az elválasztás a natív oldalon lévő fehérjemolekula méretétől és alakjától függ. |
| A fehérje stabilitása | |
| A fehérje stabilitása alacsony az SDS oldalon. | A fehérje stabilitása magas a natív oldalon. |
| Az eredeti fehérje visszanyerése | |
| Nem lehetséges, mivel az SDS oldalon denaturálva van. | A natív oldalon lehetséges. |
Összefoglaló – SDS-oldal kontra natív oldal
SDS Page és Native Page a fehérjék szétválasztására használt poliakrilamid gél elektroforézis két típusa. Az SDS old alt SDS nevű tisztítószerrel kezelik. Az SDS általános negatív töltést kölcsönöz a fehérjének, ami a fehérje denaturálódását eredményezi. Ezért a fehérjéket molekulatömegük alapján választják el. Ezzel szemben a Native Page technika nem használ denaturáló szert. Így a fehérjék méretük vagy alakjuk alapján különülnek el. Ez a különbség az SDS-oldal és a natív oldal között.
