Kulcs különbség – RT PCR vs QPCR
A polimeráz láncreakció a DNS egy meghatározott régiójának in vitro amplifikálására használt technika. Ennek a technikának Kary Mullis által 1983-ban történő feltalálása révén a tudósok képesek ezer-millió másolatot készíteni meghatározott DNS-fragmensekről kutatási célokra. Jelenleg a klinikai és kutatólaboratóriumokban elterjedt és rutinszerűen alkalmazott technikává vált az alkalmazások széles körében. A hagyományos PCR-technikának vannak változatai, mint például az RT PCR, a beágyazott PCR, a multiplex PCR, a Q PCR, az RT – QPCR stb. Az RT PCR és a Q PCR a PCR két fontos változata. A legfontosabb különbség az RT PCR és a Q PCR között az, hogy az RT PCR-t a génexpresszió kimutatására használják komplementer DNS (cDNS) átiratok RNS-ből történő létrehozása révén, míg a Q PCR-t a PCR termékek valós idejű kvantitatív mérésére használják fluoreszcens festékek használatával.
Mi az RT PCR?
Reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (RT PCR) a PCR egyik változata, amelyet az RNS expresszió kimutatására használnak. Nagyon fontos módszer az mRNS expresszió kimutatására szövetekben. RT PCR-t akkor alkalmazunk, ha a minta kiindulási anyaga RNS. Az RT PCR során a templát mRNS először komplementer DNS-vé alakul. Ezt a lépést a reverz transzkriptáz enzim katalizálja, és a folyamatot reverz transzkripciónak nevezik. Másodszor, hagyományos PCR-t alkalmaznak az újonnan szintetizált cDNS-hez az amplifikációhoz.
RT PCR egy nagyon érzékeny technika, amely viszonylag kis mennyiségű RNS mintát igényel. Az RT PCR-t általában az RNS-fajok, különösen az RNS-vírusok, például a humán immundeficiencia vírus és a hepatitis C vírus diagnosztizálására és mennyiségi meghatározására használják.
01. ábra: RT PCR technika
Mi az a QPCR?
A kvantitatív PCR (QPCR) a PCR egy változata, amelyet a PCR-termékek kvantitatív mérésére használnak. Valós idejű polimeráz láncreakciónak is nevezik, mivel valós idejű PCR gép segítségével méri a valós idejű amplifikációt. Megfelelő módszer a mintában jelen lévő célszekvencia vagy gén mennyiségének meghatározására. A QPCR érdekessége, hogy egyetlen lépésben egyesíti az amplifikációt és a valódi kvantifikációt. Ezért a detektálás során a gélelektroforézis szükségessége kiküszöbölhető QPCR technikával. A QPCR fluoreszcens festékeket használ a PCR-termékek jelölésére a PCR-reakciók során, amelyek végül közvetlen mennyiségi meghatározáshoz vezetnek. Amikor a PCR-termékek felhalmozódnak, a fluoreszcens jelek is felhalmozódnak, és azt a valós idejű gép méri. A QPCR kombinálható RT PCR-rel. RT – QPCR vagy QRT – PCR néven ismert, és a leghatékonyabb, legérzékenyebb és kvantitatív módszernek számít az RNS-szintek kimutatására a sejtekben vagy szövetekben.
A SYBR Green és a Taqman két módszer, amelyet a valós idejű PCR amplifikációs folyamatának kimutatására vagy figyelésére használnak. A SYBR Green módszert egy SYBR green nevű fluoreszcens festékkel hajtják végre, és az amplifikációt úgy érzékeli, hogy megköti a festéket, így kétszálú DNS-t állítanak elő. A Taqman-t kettős jelölésű szondákkal hajtják végre, és a szonda Taq polimeráz általi lebomlásával és a fluorofor felszabadulásával érzékeli az amplifikációt, ahogy az a 02. ábrán látható. Mindkét módszer figyeli az amplifikációs folyamat előrehaladását, és valós időben jelenti a termék mennyiségét..
A valós idejű PCR számos alkalmazási területtel rendelkezik, mint például a génexpresszió mennyiségi meghatározása, mikroRNS és nem kódoló RNS elemzés, SNP genotipizálás, kópiaszám-változatok kimutatása, ritka mutációk kimutatása, genetikailag módosított szervezetek kimutatása, fertőző ágensek kimutatása stb.
02. ábra: Kvantitatív PCR-technika
Mi a különbség az RT PCR és a QPCR között?
RT PCR vs QPCR |
|
| RT A PCR a génexpresszió amplifikációval történő kimutatására használt technika. | A QPCR egy olyan technika, amely amplifikálja a DNS-t és valós időben számszerűsíti a PCR-termékeket. |
| Reverz transzkriptáz enzim részvétele | |
| Enzim reverz transzkriptázt használunk az RT PCR-hez. | Az enzim reverz transzkriptázt nem használják a QPCR-hez. |
| Fluoreszcensen jelölt molekulák használata | |
| Fluoreszcensen jelölt festékeket vagy szondákat nem használnak az RT PCR-hez. | Fluoreszcensen jelölt festékeket vagy szondákat használnak a QPCR-hez. |
| A PCR-termék mennyiségi meghatározása | |
| Hacsak nem QPCR-rel párosul, az RT PCR nem határozza meg a PCR-termék mennyiségét. | QPCR kvantitatívan mérje meg a PCR-terméket. |
| Kiinduló anyag | |
| A kiindulási anyag az mRNS. | A kiindulási anyag a DNS. |
| A cDNS szintézise | |
| Az RT PCR során komplementer DNS termelődik. | A QPCR során nem termelődik komplementer DNS. |
Összefoglaló – RT PCR vs QPCR
RT PCR és QPCR a hagyományos PCR két változata. Az RT PCR technikát mRNS-mintákra hajtják végre, és a reverz transzkripció és a cDNS termelése hajtja. A QPCR-t a PCR termékek számszerűsítésére használják a valós idejű PCR termikus ciklusok során fluoreszcens festékek vagy jelölt próbák segítségével. A QPCR során a PCR termék mennyiségét a minta által kibocsátott fluoreszcens jelek jelentik. Az RT PCR-t gyakran használják amplifikációs eljárásként, míg a QPCR-t általában kvantifikációs eljárásként használják. Ez a különbség az RT PCR és a QPCR között.
