Kiemelt különbség – nitrocellulóz vs PVDF
A Western blot egy olyan módszer, amely lehetővé teszi specifikus fehérjék kimutatását és mennyiségi meghatározását egy fehérjemintából. A technika megbízhatósága a fehérjék gélből történő felszívódásához megfelelő membrán kiválasztásától függ. Különféle típusú mikroporózus membránok léteznek. A nitrocellulóz és a PVDF membránok két ilyen membránt preferálnak a kutatók, mivel különleges tulajdonságaik a többi membrántípushoz képest. A nitrocellulóz vagy a PVDF közötti választás szintén kihívást jelent a Western-blot vizsgálatban. Mind a nitrocellulóznak, mind a PVDF-nek magas a fehérjeabszorpciós kapacitása. A legfontosabb különbség a nitrocellulóz és a PVDF membrán között az, hogy a nitrocellulóz membránok nem képesek az antitestek eltávolítására és a membránok újrafelhasználására antitestek újrapróbálására, míg a PVDF membránok lehúzó és újrafelhasználó képességgel rendelkeznek.
Mi az a nitrocellulóz?
A nitrocellulóz cellulóz salétromsavval történő kezelésével előállított polimer, és mikroporózus membránok készítésére használják a molekuláris biológiában, különösen az olyan blottolási technikákhoz, mint a Southern, Northern és Western blotting. A nitrocellulóz membránok pórusmérete 3 és 20 µm között van. A nitrocellulóz mikroporózus membránok megkönnyítik a membrán felületén lejátszódó immunkémiai reakciók kimutatását. Ezért a nitrocellulóz membránokat gyakran használják fehérjék immobilizálására és specifikus fehérjék kimutatására a Western blotting során. A nitrocellulóz membránok a glikoproteineket és a nukleinsavakat is rögzíthetik.
A nitrocellulóz membránokat részesítik előnyben az oldalirányú áramlási vizsgálatokban, számos jellemző miatt. A nitrocellulóz membránok nagy koncentrációban szívják fel a fehérjéket. A membrán nedvesítésére használt oldószer nem csökkenti a nitrocellulóz membránfehérje felszívódását. A nitrocellulóz membránok könnyen a kívánt gélméretre vághatók, és elektromos vagy kapilláris transzferrel fehérjéket vihetnek át a gélből a membránba. A nitrocellulóz lehetővé teszi a fehérjék gyorsabb áramlását a membránon keresztül, magas kötési potenciállal. A nitrocellulóz jobb kezelhetőséget mutat. A nitrocellulóz membrán másik különleges tulajdonsága, hogy oldószermentes, vízálló ragasztókkal könnyen felragasztható különféle műanyag hátlapokra.
01. ábra: Nitrocellulóz membrán Western blottinghoz
Mi az a PVDF?
A polivinilidén-difluorid (PVDF) egy fluorpolimer, amelyet vinilidén-difluorid polimerizációjával állítanak elő, és magas a fehérjék immobilizálási képessége. Ezért a PVDF-ből készült mikroporózus membránokat Western-blot technikákban használják a fehérjék keverékéből származó specifikus fehérjék elemzésére. A PVDF membránok aminosav-analízishez és fehérjeszekvenáláshoz is használhatók. A PVDF membrán legfontosabb jellemzője a nitrocellulóz membrán felett, hogy könnyen eltávolítható az antitestekről, és újra felhasználható a következő antitest-próbákhoz.
A PVDF membránok vastagabbak, mint a nitrocellulóz membránok; így jobban ellenáll az újrahasználat során bekövetkező sérüléseknek. A PVDF membránok erősen hidrofóbok. Ezért használat előtt metanolba vagy izopropanolba kell áztatni.
Mi a különbség a nitrocellulóz és a PVDF között?
Nitrocellulóz vs PVDF |
|
| A nitrocellulóz cellulózból álló polimer. | A PVDF egy fluorpolimer, amelyet vinilidén-difluorid polimerizálásával állítanak elő. |
| Membránpórusméret | |
| A tipikus pórusméretek 0,1, 0,2 vagy 0,45 μ | A tipikus pórusméretek 0,1, 0,2 vagy 0,45 μm |
| Fehérjekötő kapacitás | |
| A nitrocellulóz fehérjemegkötő kapacitása 80-100 μg/cm2. | A PVDF fehérjemegkötő kapacitása 170-200 μg/cm2. |
| Érzékenység | |
| Ennek a PVDF-hez képest alacsony az érzékenysége. | Ez nagy érzékenységű. |
| Alacsony expressziójú fehérjék kimutatása | |
| Mivel a nitrocellulóz membránokban alacsony az érzékenység, nem alkalmas alacsony expressziójú fehérjék kimutatására. | Nagy érzékenysége miatt alkalmasabb a gyengén expresszált fehérjék kimutatására. |
| Háttérzaj | |
| Ennek alacsonyabb a háttérzaja | Ennek magasabb a háttérzaja. |
| Kölcsönhatások fehérjékkel | |
| A fehérjemolekulák hidrofób kölcsönhatások révén kötődnek a nitrocellulóz membránokhoz. | A fehérjék hidrofób és dipól kölcsönhatások révén kötődnek a PVDF membránokhoz. |
| A membrán természete | |
| A nitrocellulóz törékeny és törékeny. A nitrocellulóznak azonban vannak változatai, amelyek ellenállóak. | A PVDF tartósabb és nagyobb a vegyszerállósága. |
| Leválasztás és újrafelhasználás lehetősége | |
| A nitrocellulóznak nehézséget okozhat a sztrippelés és újraszondázás a jel elvesztése nélkül. | A PVDF ideális az újrapróbálási és szekvenálási alkalmazásokhoz. |
| Alkalmasság | |
| A nitrocellulóz ideális az alacsony molekulatömegű fehérjék kimutatására. | A PVDF alkalmasabb nagyobb molekulatömegű fehérjék kimutatására. |
| Egyéb felhasználások | |
| A nitrocellulóz használható nukleinsavelemzésre és dot/slot blottingra. | A PVDF fehérjeszekvenáláshoz és szilárd fázisú vizsgálati rendszerekhez használható. |
| Költség | |
| Ez olcsóbb, mint a PVDF membránok. | Ez drágább, mint a nitrocellulóz membránok. |
| Előnedvesítés szükséges | |
| A nitrocellulóz membránok nem igényelnek metanolos előzetes áztatást | A PVDF membránok előáztatást igényelnek metanollal. |
Összefoglaló – Nitrocellulóz vs PVDF
A nitrocellulóz membránok voltak az első membránok, amelyeket kereskedelmi forgalomban használtak oldalirányú áramlási vizsgálathoz. Nagy kapacitásuk van a fehérjék felszívására. Ezért nitrocellulóz membránokat használnak a Western blottolás során. A PVDF egy másik típusú membrán, amelyet a Western blottingban használnak, és magas fehérjeabszorpciós kapacitással rendelkezik. Mindkét típust a Western blot-ban használják fehérjeanalízishez. A PVDF membránok azonban speciálisabb tulajdonságokkal rendelkeznek, így a nitrocellulóz membránoknál alkalmasabbak Western blottolásra. De a nitrocellulóz membránok alkalmasabbak az alacsony molekulatömegű fehérjék kimutatására, a PVDF membránok pedig a nagy molekulatömegű fehérjék kimutatására. Ez a különbség a nitrocellulóz és a PVDF membránok között.
