Kiemelt különbség – SYBR Green vs Taqman
A SYBR Green és a Taqman két módszer, amelyet a valós idejű PCR amplifikációs folyamatának észlelésére vagy figyelésére használnak. A SYBR Green egy interkalációs nukleinsavfestő festéken alapuló módszer, míg a Taqman egy hidrolízisszondán alapuló módszer. Mindkét technológiát úgy tervezték, hogy fluoreszcenciát generáljon a PCR során, ami lehetővé teszi a valós idejű PCR-gép számára a reakció „valós időben történő” nyomon követését. A SYBR Green módszert egy SYBR green nevű fluoreszcens festékkel hajtják végre, és az amplifikációt úgy érzékeli, hogy a festéket a termelt kétszálú DNS-hez köti. A Taqman-t kettős jelölésű próbákkal hajtják végre, és kimutatja az amplifikációt a próba Taq polimeráz általi lebontásával és a fluorofor felszabadulásával. Ez a legfontosabb különbség a SYBR Green és a Taqman között.
Mi az a SYBR Green?
A SYBR Green egy fluoreszcens festék, amelyet nukleinsavak, különösen a kétszálú DNS megfestésére használnak a molekuláris biológiában. A SYBR Green módszert használják a PCR termékek számszerűsítésére a valós idejű PCR során. Miután a DNS-hez kötődik, a kapott DNS-festék komplex elnyeli a kék fényt, és intenzív zöld fényt bocsát ki. Ez annak a szerkezeti változásnak köszönhető, amely a festékmolekulában a kettős szálú DNS-hez való kötődéskor következik be. Amikor a PCR egyre több DNS-t hoz létre, több festékmolekula kötődik a DNS-hez, és több fluoreszcenciát generál. Ezért a fluoreszcencia a PCR-termék felhalmozódásával növekszik. Ezért a PCR-termék mennyisége kvantitatívan mérhető a SYBR Green fluoreszcencia detektálással.
A SYBR zöld festék citometriában és fluoreszcens mikroszkópiában DNS-jelölésre is használható. Az etidium-bromidot sikeresen felváltotta a SYBR Green, mivel az etidium-bromid egy rákkeltő festék, amely a gélelektroforézis során a DNS-megjelenítés során problémákba ütközik.
A SYBR zöld módszernek előnyei és hátrányai is vannak. Ez a módszer nagyon érzékeny, olcsó és könnyen használható. Azonban, mivel képes bármely kétszálú DNS-hez kötődni, a nem specifikus kötődés a PCR-termék túlzott mennyiségi meghatározásához vezethet.
01. ábra: SYBR Green Technique
Mi az a Taqman?
A Taqman a SYBR Green alternatív módszere a valós idejű PCR folyamat monitorozására. Ez a módszer a Taq polimeráz enzim 5’-3’ exonukleáz aktivitásától függ, hogy lebontja a próbákat az új szál kiterjesztése és a fluorofor felszabadulása során. Ebben a módszerben kettős jelölésű szondákat használnak, és a szondák hidrolízisén alapul. A próbák fluoreszcensen jelölt DNS-oligonukleotidok, amelyek 5'-végén egy fluoreszcens riportermolekula (fluorofor) és 3'-végén egy kioltó molekula található. Úgy tervezték, hogy az egyszálú sablonhoz kötődjenek a primer lágyítások ellenkező oldalán. A Taq polimeráz nukleotidokat ad a primerhez, és kiterjeszti az új szálat a kettős jelölésű próbák felé. Amint a Taq polimeráz találkozik a próbával, a Taq polimeráz exonukleáz hatása aktiválja és lebontja a próbát. Miután befejezte az új szál szintézisét, a szondát teljes lebomlásnak vetik alá, és felszabadítják a fluorofort. A fluorofor felszabadulása fluoreszcenciát generál. A fluoreszcens Quencher molekula hatékonyan kioltja a kibocsátott fényt, és létrehozza a kimenetet a PCR termék mennyiségi meghatározásához. A fluoroforok felszabadulása és a PCR termékek mennyisége arányos. Ezért a számszerűsítés könnyen elvégezhető a Taqman-módszerrel.
02. ábra: Taqman-módszer
A Taqman-módszert valós idejű PCR-re, a génexpresszió mennyiségi meghatározására, genetikai polimorfizmusok kimutatására, kromoszómális DNS-deléciók számszerűsítésére, bakteriális azonosításra, microarray analízis ellenőrzésére, SNP genotipizálásra stb. használják.
Mi a különbség a SYBR green és a Taqman között?
SYBR Green vs Taqman |
|
| SYBR Green a DNS-kötő festéken alapul. | A Taqman a hibridizációs próbáktól és a Taq polimeráz 5-3 percnyi exonukleáz aktivitásától függ. |
| Fluoreszkáló címkével ellátott szondák | |
| Nincs szükség fluoreszcensen jelölt szondákra. | Kettős címkével ellátott szondák szükségesek. |
| Multiplex génelemzés | |
| Nem használható multiplex géncélokhoz. | Használható multiplex géncélpontokhoz. |
| Költség | |
| Ez olcsóbb. | Ez drágább. |
| Specifikusság | |
| Ez kevésbé specifikus, és bármely kétszálú DNS-hez kötődik | Ezek nagyon specifikusak, mivel a szondák érzékelik a specifikus amplifikációs termékeket. |
| Hatékonyság | |
| Ez kevésbé hatékony. | Ez nagyon hatékony. |
| Alkalmazás | |
| Ezt valós idejű PCR-re, agarózgél-vizualizációra, DNS-jelölésre stb. használják. | Ezt valós idejű PCR-re, a génexpresszió mennyiségi meghatározására, genetikai polimorfizmusok kimutatására stb. használják. |
Összefoglaló – SYBR Green és Taqman
A Taqman és a SYBR green a valós idejű PCR (kvantitatív PCR) két módszere. Mindkét módszer lehetővé teszi a PCR-termék hatékony mennyiségi meghatározását, és a fluoreszcencia emissziójára támaszkodik. A Taqman módszer kettős jelölésű próbákat használ a felhalmozódott DNS kimutatására, míg a SYBR Green módszer fluoreszcens festéket használ. Mindkét módszernek különböző alkalmazásai vannak a molekuláris biológiában.
