Kiemelt különbség – PCR primerek és szekvenáló primerek
A molekuláris biológia területén a közelmúltban bekövetkezett fejlemények során különböző genetikai technikákat fejlesztettek ki, amelyek egyszerűvé és pontossá tették a téma különböző irányvonalainak vizsgálatát. A PCR és más szekvenálási eljárások két fontos ilyen technika. Különböző alkomponenseket használnak. A primerek mind a PCR, mind a szekvenálási technikák közös fő alkomponensének tekinthetők. A PCR-láncindítókat egy adott DNS-szekvencia amplifikálására, míg a szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben azzal a céllal, hogy felfedjék a nukleotidszekvencia specifikus sorrendjét. Ez a legfontosabb különbség a PCR primerek és a szekvenáló primerek között.
Mik azok a PCR primerek?
A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan genetikai technika, amelyet a molekuláris biológia területén alkalmaznak egy adott DNS-szakasz egy vagy néhány másolatának amplifikálására, és sok millió azonos másolat készítésére. A PCR-reakcióban különböző komponenseket használnak, beleértve a primereket. A primerek rövid DNS-szálak, 18-25 nukleotid hosszúságúak, így kompatibilisek az amplifikálandó DNS-fragmensek kezdő- és végrégiójával. A primerek lehetnek előre és fordított alapozók. Ezek a primerek azokon a specifikus pontokon kötődnek a DNS-fragmenshez, ahol a DNS-polimerázt a specifikus primerhez köti, és elindítja az új DNS-szál szintézisét.
A primerek kiválasztása a PCR folyamat egyik fontos szempontja. Fontos az alapozó hosszának kiválasztása. Az ideális hosszúság 18-25 nukleotid lenne. Ha a hossza túl rövid vagy túl hosszú, a primerek nem kötődnek a DNS-szekvenciához, hogy pontosan amplifikálják. A túl rövid láncindítók a DNS-szekvencia különböző helyein nem specifikus primerek összekapcsolódásához vezetnek.
01. ábra: PCR primerek
A guanin és citozin (GC) tartalmának egy jó alapozóban a 40-60 tartományban kell lennie. A primer lágyítási hőmérséklete és olvadási hőmérséklete létfontosságú tényező a PCR során. Az olvadási hőmérsékletet pontosan kell kiszámítani, és a primer lágyítási hőmérsékletének 5 0C-kal alacsonyabbnak kell lennie, mint az olvadási hőmérséklet. Az olvadási hőmérséklet 60 °C és 75 °C legyen. A túl magas vagy túl alacsony hőmérséklet kevésbé aktív DNS polimeráz aktivitást eredményez.
Mik azok a szekvenáló primerek?
A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben használják, azzal a szándékkal, hogy felfedjék annak specifikus azonosságát. A jó szekvenálási eredmények eléréséhez fontosak a jó minőségű primerek és sablonok. Így a primerek kiválasztásakor egyedinek kell lenniük egy adott régióban, ahol szekvenálni szeretnénk. Megfelelő orientációjúnak kell lennie, ahol a szekvenciák általában a primerek 3'-5' végeitől jönnek létre. A szekvenciából hiányozni kell a nemkívánatos önhibridizációt, például a hajtűhurkok képződését. Nem tartalmazhat guanin bázisok egymást követő képződését.
A primer olvadási hőmérsékletének (Tm) meg kell felelnie a szekvenálás körülményeinek. Ezért 52oC és 74oC között kell lennie. A primerként használandó oligonukleotidok előkészítését meg kell tisztítani, hogy megkapjuk a kívánt teljes hosszúságú szekvenciát. Ha az oligonukleotidok szennyeződéseket tartalmaznak, akkor a primer szekvencia jelátvitel különböző primer helyekről fog átkerülni, és ez csökkenti a bázissejtek számát is.
02. ábra: Alapozók szekvenálása
Egy oligonukleotid primer olvadási hőmérséklete (Tm) határozza meg, hogy a komplementer DNS-szálak milyen erősen hibridizálódnak egymással. A Tm termodinamikai számításnak tekinthető, ahol egyaránt függ a DNS-szekvenciáktól és számos körülménytől, például a sókoncentrációtól. A Tm fontos a PCR során, ahol a ciklus szekvenálásnak nevezett variánst használnak didezoxinukleotid-terminált fragmensek csoportjának előállítására. Itt a szekvenált primert kezdetben alternatív módon annealizálják, majd meghosszabbítják, és végül denaturálják az amplifikációhoz. Ezért a Tm értéknek 52oC és 74o C között kell lennie. A szintetizált oligonukleotidok beszerezhetők DNS/RNS-szintézis laboratóriumokból az alábbiak szerint. választás. A DNS-szekvenáláshoz használt kis léptékű szintézis általában 50 nmol. Szintén a legfontosabb, hogy a szekvenáláshoz használt primereket meg kell tisztítani, hogy ne legyenek olyan szennyeződésektől, amelyek megakadályozzák a minőség romlását.
Mi a hasonlóság a PCR primerek és a szekvenáló primerek között?
- Mind a PCR-primerek, mind a szekvenáló primerek olyan primerek, amelyeket egy megcélzott DNS-szekvencia amplifikációs folyamatában használnak.
- Mind a PCR primer, mind a szekvenáló primer nukleotidokból áll.
- Mind a PCR-primerek, mind a szekvenáló primerek rövid oligomerek.
Mi a különbség a PCR primerek és a szekvenáló primerek között?
PCR primerek vs szekvenáló primerek |
|
| A PCR primerek rövid DNS-szálak, amelyek nukleotidszekvenciája 18-25 hosszú, így kompatibilisek az amplifikálandó DNS-fragmensek kezdő és végrégiójával. | A szekvenáló primerek rövid oligomerek, amelyeket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben használnak azzal a szándékkal, hogy felfedjék annak specifikus azonosságát. |
| Funkció | |
| A PCR primereket egy adott DNS-szekvencia amplifikálására használják. | A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben használják, azzal a szándékkal, hogy felfedjék annak specifikus azonosságát. |
| A szükséges alapozók száma | |
| Két alapozó; egy előre és egy fordított primert használnak PCR primerként. | Csak egy primerre van szükség szekvenáló alapozóként. |
Összefoglaló – PCR primerek vs szekvenáló primerek
A szekvenáló primereket egy DNS-fragmens szekvenálásával összefüggésben használják, azzal a szándékkal, hogy felfedjék annak specifikus azonosságát. Egy szekvenáló primer elegendő lesz a folyamat futtatásához. A jó szekvenálási eredmények eléréséhez fontosak a jó minőségű primerek és sablonok. Így a primerek kiválasztásakor egyedinek kell lenniük egy adott régióban, ahol szekvenálni szeretnénk. A PCR primerek 18-25 nukleotid hosszúságú rövid DNS-szálak, amelyek kompatibilisek az amplifikálandó DNS-fragmensek kezdő- és végrégiójával. A PCR primerek lehetnek előre és fordított primerek. A guanin és citozin (GC) tartalma egy jó primerben a 40-60 tartományban legyen. A primer lágyítási hőmérséklete és olvadási hőmérséklete létfontosságú szempont a PCR során. Ez a különbség a PCR primerek és a szekvenáló primerek között.
