Kiemelt különbség – északi vs déli vs Western blotting
A DNS, RNS és fehérjék specifikus szekvenciáinak kimutatása alapvető fontosságú a molekuláris biológia különböző típusú tanulmányaihoz. A gélelektroforézis egy olyan technika, amely a DNS-t, az RNS-t és a fehérjéket méretük szerint választja el. A gélprofilokból egy adott DNS-szekvenciát, RNS-szekvenciát vagy fehérjét detektálnak speciális technikákkal, amelyeket blottolásnak és jelölt próbákkal történő hibridizációnak neveznek. Három különböző típusú blottolási módszer létezik, nevezetesen a déli, az északi és a nyugati. A Northern Southern és Western blotting közötti kulcsfontosságú különbség a mintából észlelt molekula típusában rejlik. A Southern-blot egy olyan módszer, amely egy DNS-mintából egy specifikus DNS-szekvenciát mutat ki. A Northern blot egy olyan technika, amely egy specifikus RNS-szekvenciát mutat ki egy RNS-mintából. A Western-blot egy olyan módszer, amely egy specifikus fehérjét detektál egy fehérjemintából.
Mi az a Southern Blotting?
A Southern blotting technikát E. M. Southern fejlesztette ki 1975-ben egy adott DNS-szekvencia DNS-mintából történő azonosítására. Ez az első blottolási technika, amelyet a molekuláris biológiában vezettek be. Lehetővé tette specifikus gének kimutatását a DNS-ből, specifikus fragmentumokat a DNS-ből stb. A southern blotting technikának több lépése is van. Ezek a következők.
- A DNS-t izoláljuk a mintából, és restrikciós endonukleázokkal emésztjük.
- Az emésztett mintát Agarose gélelektroforézissel választjuk el.
- A gélben lévő DNS-fragmenseket lúgos oldat segítségével egyetlen szálra denaturálják.
- Az egyszálú DNS-t kapilláris átvitellel nitrocellulóz szűrőmembránra visszük át.
- Az átvitt DNS tartósan a membránon rögzül.
- A membránon lévő rögzített DNS-t jelölt próbákkal hibridizálják.
- A kötetlen DNS-t mosással lemossuk a membránról.
- Röntgenfilmet teszünk a membránra, és autoradiográfiát készítünk.
A Southern blottingot a molekuláris biológia különböző aspektusaira alkalmazzák. Hasznos RFLP-térképezésben, törvényszéki vizsgálatokban, DNS-metilációban a génexpresszióban, mutált gének kimutatásában genetikai rendellenességekben, DNS-ujjlenyomat-vételben stb.
01. ábra: Southern-blot-technika
Mi az a Northern Blotting?
A Northern blotting egy olyan módszer, amelyet egy specifikus RNS-szekvencia vagy mRNS-szekvencia kimutatására terveztek egy mintából a génexpresszió tanulmányozása céljából. Ezt a technikát Alwine, Kemp és Stark fejlesztette ki 1979-ben. Több lépésben különbözik a southern és western blotting technikáktól. Ezt a technikát azonban gélelektroforézissel, blottolással és specifikus jelölt próbákkal történő hibridizációval és detektálással is végrehajtják. A Northern blot technikát a következőképpen hajtjuk végre.
- RNS-t vonunk ki a mintából, és gélelektroforézissel választjuk el.
- RNS-t viszünk át a gélről egy blotting membránra és rögzítjük.
- A membránt cDNS-ből vagy RNS-ből készített jelölt próbával kezeljük (a próba komplementer a mintában lévő specifikus szekvenciával).
- A szondát a membránnal inkubáljuk, hogy egy meghatározott szekvenciával kötődjön.
- A kötetlen szondákat lemosták.
- A hibridizált töredékeket autoradiográf észleli.
A Northern blot fontos eszköz a hibridizált mRNS kimutatásában és mennyiségi meghatározásában, az RNS lebomlásának tanulmányozásában, az RNS felezési idejének értékelésében, az RNS splicing kimutatásában, a génexpresszió tanulmányozásában stb.
02. ábra: Northern Blotting
Mi az a Western Blotting?
A Western-blot módszer egy specifikus fehérje kimutatására fehérjekeverékből, jelölt antitestek használatával. Ezért a Western blot immunblotként is ismert. Ezt a technikát Towbin és munkatársai vezették be 1979-ben, és ma már rutinszerűen elvégzik a laboratóriumokban fehérjeelemzés céljából. A lépések a következők.
- A fehérjéket kivonják a mintából
- A fehérjéket méretük szerint választják el poliakrilamid gélelektroforézissel
- Az elválasztott molekulákat elektroporációval PVDF membránba vagy nitrocellulóz membránba visszük át
- A membrán blokkolva van, mert nem specifikusan kötődik az antitestekhez
- Az átvitt fehérjék elsődleges antitesttel (enzimmel jelölt antitestekkel) kötődnek.
- A membránt megmossuk, hogy eltávolítsuk a nem specifikusan megkötött elsődleges antitesteket
- A megkötött antitestek kimutatása szubsztrát hozzáadásával és a képződött színes csapadék kimutatásával történik
A Western-blot-vizsgálat hasznos a HIV-ellenes antitestek kimutatására humán szérummintában. A Western blot a hepatitis B fertőzés megerősítő tesztjeként és a kergemarhakór végleges tesztjeként is használható.
03. ábra: Western blotting
Mi a különbség a Northern Southern és a Western Blotting között?
Northern vs South vs Western Blotting |
|
| Az észlelt molekula típusa | |
| Northern Blotting | A Northern blotting egy specifikus RNS-szekvenciát detektál egy RNS-mintából. |
| Southern Blotting | Southern blotting egy DNS-mintából egy meghatározott DNS-szekvenciát detektál. |
| Western Blotting | A Western blot egy specifikus fehérjét detektál egy fehérjemintából. |
| Gél típusa | |
| Northern Blotting | Ez agaróz/formaldehid gélt használ. |
| Southern Blotting | Ez egy Agarose gélt használ. |
| Western Blotting | Ez poliakrilamid gélt használ. |
| Blottolási módszer | |
| Northern Blotting | Ez egy kapilláris átvitel. |
| Southern Blotting | Ez egy kapilláris átvitel. |
| Western Blotting | Ez egy elektromos transzfer. |
| Használt szondák | |
| Northern Blotting | Radioaktívan vagy nem radioaktívan jelölt cDNS- vagy RNS-próbák. |
| Southern Blotting | A DNS-szondák radioaktívan vagy nem radioaktívan vannak jelölve. |
| Western Blotting | Az elsődleges antitesteket szondaként használják. |
| Érzékelő rendszer | |
| Northern Blotting | Ez autoradiográf vagy fény- vagy színváltozás észlelésével történik. |
| Southern Blotting | Ez autoradiográfia segítségével történik, fény- vagy színváltozás észlelésével. |
| Western Blotting | Ez a fény- vagy színváltozás észlelésével történik. |
Összefoglaló – Northern vs South vs Western Blotting
A blottolás egy speciális technika, amelyet specifikus DNS, RNS vagy fehérje azonosítására fejlesztettek ki a mintákból. Három különálló blottolási eljárás létezik, nevezetesen északi, déli és nyugati, egy adott típusú molekula kimutatására. A Northern blotting technikát úgy tervezték, hogy RNS keverékéből egy specifikus RNS-szekvenciát detektáljon. A Southern blotting technika lehetővé teszi egy specifikus DNS-szekvencia kimutatását DNS-mintából, a Western-blot technikát pedig egy specifikus fehérje azonosítására fehérjekeverékből.
