Kulcs különbség – Microarray vs RNS szekvenálás
A transzkriptom a sejtben jelenlévő RNS teljes tartalmát képviseli, beleértve az mRNS-t, rRNS-t, tRNS-t, degradált RNS-t és nem lebontott RNS-t. A transzkriptom profilalkotása fontos folyamat a sejtbetekintések megértéséhez. Számos fejlett módszer létezik az átírási profilalkotásra. A microarray és az RNS szekvenálás kétféle technológia, amelyet a transzkriptom elemzésére fejlesztettek ki. A legfontosabb különbség a microarray és az RNS szekvenálás között az, hogy a microarray az előre megtervezett jelölt próbák hibridizációs potenciálján alapul a cél cDNS szekvenciákkal, míg az RNS szekvenálás a cDNS szálak közvetlen szekvenálásán alapul fejlett szekvenálási technikákkal, például NGS-sel. A Microarray-t a szekvenciák előzetes ismeretében, az RNS-szekvenálást pedig a szekvenciák előzetes ismerete nélkül hajtják végre.
Mi az a Microarray?
A Microarray egy robusztus, megbízható és nagy áteresztőképességű módszer, amelyet a tudósok transzkripciós profilalkotáshoz használnak. Ez a legnépszerűbb módszer az átiratelemzésre. Ez egy olcsó módszer, amely a hibridizációs próbáktól függ.
A technika az mRNS mintából történő extrakciójával és a teljes RNS-ből cDNS-könyvtár felépítésével kezdődik. Ezután szilárd felületen (foltmátrixon) fluoreszcensen jelölt, előre megtervezett szondákkal keverik össze. A komplementer szekvenciák hibridizálódnak a microarray jelölt próbáival. Ezután a microarray-t megmossák és átvizsgálják, és a képet számszerűsítik. Az összegyűjtött adatokat elemezni kell, hogy megkapjuk a relatív kifejezési profilokat.
A microarray próbák intenzitását feltételezzük, hogy arányos a mintában lévő átiratok mennyiségével. A technika pontossága azonban a tervezett próbáktól, a szekvencia előzetes ismeretétől és a próbák hibridizációs affinitásától függ. Ezért a microarray technológiának vannak korlátai. A Microarray technika nem hajtható végre alacsony abundanciájú átiratokkal. Nem képes megkülönböztetni az izoformákat és azonosítani a genetikai változatokat. Mivel ez a módszer a próbák hibridizációjától függ, a hibridizációval kapcsolatos néhány probléma, például kereszthibridizáció, nem specifikus hibridizáció stb. előfordul a microarray technikában.
01. ábra: Microarray
Mi az az RNS-szekvenálás?
RNS shotgun szekvenálás (RNA seq) egy nemrégiben kifejlesztett teljes transzkriptom szekvenálási technika. Ez az átírási profilalkotás gyors és nagy áteresztőképességű módszere. Közvetlenül számszerűsíti a gének expresszióját, és a transzkriptom mélyreható vizsgálatát eredményezi. Az RNS-seq nem függ az előre megtervezett próbáktól vagy a szekvenciák előzetes ismeretétől. Ezért az RNS-seq módszer nagy érzékenységgel rendelkezik, és képes új gének és genetikai változatok kimutatására.
RNS szekvenálási módszert több lépésben hajtanak végre. A sejt teljes RNS-ét izolálni és fragmentálni kell. Ezután reverz transzkriptáz segítségével cDNS könyvtárat kell készíteni. Minden cDNS-szálat adapterekkel kell ligálni. Ezután a ligált fragmentumokat amplifikálni és tisztítani kell. Végül egy NGS-módszert használva el kell végezni a cDNS szekvenálását.
02. ábra: RNS-szekvenálás
Mi a különbség a Microarray és az RNS szekvenálás között?
Microarray vs RNS Sequencing |
|
| A Microarray egy robusztus, megbízható, nagy áteresztőképességű módszer. | RNS-szekvenálás egy pontos és nagy áteresztőképességű módszer. |
| Költség | |
| Ez egy olcsó módszer. | Ez egy drága módszer. |
| Nagy számú minta elemzése | |
| Ez megkönnyíti nagyszámú minta egyidejű elemzését. | Ez megkönnyíti nagyszámú minta elemzését. |
| Adatelemzés | |
| Az adatelemzés összetett. | Több adat generálódik ezzel a módszerrel; ezért a folyamat összetettebb. |
| Szekvenciák előzetes ismerete | |
| Ez a módszer hibridizációs próbákon alapul, ezért a szekvenciák előzetes ismerete szükséges. | Ez a módszer nem függ az előzetes szekvencia-ismeretektől. |
| Strukturális variációk és új gének | |
| Ez a módszer nem képes kimutatni a szerkezeti eltéréseket és az új géneket. | Ez a módszer képes kimutatni a szerkezeti eltéréseket, például a génfúziót, az alternatív splicinget és az új géneket. |
| Érzékenység | |
| Ez nem képes kimutatni az izoformák kifejeződésében mutatkozó különbségeket, ezért ennek korlátozott az érzékenysége. | Ez nagy érzékenységű. |
| Eredmény | |
| Ez csak relatív kifejezési szinteket eredményezhet. Ez nem adja meg a génexpresszió abszolút mennyiségi meghatározását. | Abszolút és relatív kifejezési szinteket ad. |
| Adatújraelemzés | |
| Ezt újra le kell futtatni az újraelemzés érdekében. | A sorrendi adatok újra elemezhetők. |
| Speciális személyzetre és infrastruktúrára van szükség | |
| A microarray-hez nincs szükség speciális infrastruktúrára és személyzetre. | Az RNS-szekvenáláshoz speciális infrastruktúra és személyzet szükséges. |
| Technikai problémák | |
| A Microarray technikának olyan technikai problémái vannak, mint például a kereszthibridizáció, a nem specifikus hibridizáció, az egyes próbák korlátozott kimutatási aránya stb. | RNS-seq technika elkerüli az olyan technikai problémákat, mint a kereszthibridizáció, a nem specifikus hibridizáció, az egyes próbák korlátozott kimutatási aránya stb. |
| Elfogultságok | |
| Ez egy elfogult módszer, mivel a hibridizációtól függ. | A torzítás alacsony a microarray-hez képest. |
Összefoglaló – Microarray vs RNS szekvenálás
A Microarray és RNS szekvenálási módszerek nagy áteresztőképességű platformok, amelyeket a transzkriptom profilalkotáshoz fejlesztettek ki. Mindkét módszer olyan eredményeket ad, amelyek erősen korrelálnak a génexpressziós profilokkal. Az RNS-szekvenálásnak azonban vannak előnyei a microarray-hez képest a génexpressziós elemzéshez. Az RNS-szekvenálás érzékenyebb módszer az alacsony abundanciájú transzkriptumok kimutatására, mint a microarray. Az RNS-szekvenálás lehetővé teszi az izoformák megkülönböztetését és a génváltozatok azonosítását is. A legtöbb kutató azonban a microarray-t választja, mivel az RNS-szekvenálás egy új és drága technika, adattárolási kihívásokkal és összetett adatelemzéssel.
