Kiemelt különbség – génklónozás vs PCR
A sok DNS-másolat szintézisét egy adott DNS-fragmensből DNS-amplifikációnak nevezik. Két fő DNS-amplifikációs folyamat létezik, nevezetesen a génklónozás és a PCR. A génklónozás és a PCR közötti kulcsfontosságú különbség az, hogy a génklónozás egy adott gén többszörös másolatát állítja elő in vivo egy rekombináns DNS felépítésével és a gazdabaktériumban való növekedéssel, míg a PCR egy specifikus DNS-fragmens több millió példányát állítja elő in vitro, amelyek ismételt ciklusokon mennek keresztül. denaturáció és szintézis.
Mi az a génklónozás?
A génklónozás egy olyan technika, amellyel egy szervezetből kivont genomiális DNS-ből egy specifikus gént azonosítanak és szaporítanak rekombináns DNS felépítésével. A genomi DNS több ezer különböző gént tartalmaz fehérjékre kódolva. Amikor a DNS-t kivonják, minden lehetséges gént magában foglal, amit el tud viselni. A génklónozási technika lehetővé tette egy adott gén kimutatását a teljes DNS-ből. Ezért a génklónozás fontos eszközként szolgál a molekuláris biológiában.
Egy organizmus genomiális könyvtárának elkészítése elengedhetetlen a génklónozás során, ha nincs nyom a megfelelő gén elhelyezkedéséről a DNS-ben. A genomikus könyvtár a következő lépésekkel készül.
1. lépés: A teljes DNS kinyerése a kívánt gént tartalmazó szervezetből.
2. lépés: A kivont DNS restrikciós emésztése kis kezelhető fragmentumok előállításához. Ezt a lépést a restrikciós endonukleázok segítik elő.
3. lépés: Egy megfelelő vektor kiválasztása és a vektor-DNS megnyitása ugyanazon restrikciós endonukleázok használatával. A bakteriális plazmidokat általában vektorként használják idegen DNS hordozására. A plazmidok kis DNS körök, amelyek a baktériumokon belül helyezkednek el.
4. lépés: A vektor-DNS és a fragmentált DNS kombinálása rekombináns DNS-molekula előállításához. Ezt a lépést a DNS-ligáz szabályozza.
5. lépés: Rekombináns DNS-molekulák átvitele gazdabaktériumba. Ezt a lépést transzformációnak nevezik, és hősokk segítségével történik.
5. lépés: A transzformált baktériumsejtek szűrése táptalajon. A transzformált és nem transzformált gazdasejtek vegyes populációját kapjuk a transzformációs folyamat végén. Mivel az érdeklődésre számot tartó gén csak a transzformált gazdasejtekben található. Ezért szükséges a transzformált sejteket kiválasztani. A kiválasztás szelektív, antibiotikumot tartalmazó tápközeggel történik. Csak a transzformált sejtek nőnek ezen a szűrési táptalajon, ami lehetővé teszi a szelekciót.
6. lépés: Baktériumok szaporítása génkönyvtár létrehozásához. Ebben a lépésben a transzformált gazdasejteket friss tápközegbe visszük, amely optimális növekedési igényt biztosít. A tenyészlemezeken lévő összes telep az adott organizmus genomiális könyvtárát képviseli.
7. lépés: A kérdéses gént tartalmazó rekombináns DNS-molekulát a rekombináns DNS több ezer klónozott fragmentumából kell átvizsgálni. Ez olyan próbák használatával érhető el, amelyek megjelölik a specifikus gént, vagy a specifikus fehérje abból a génből származik.
Miután a baktériumkolóniát tartalmazó érdeklődő gént azonosították az összes telep közül, több millió másolatot lehet készíteni a gént tartalmazó rekombináns plazmidról.
A génklónozást génkönyvtárak létrehozására, speciális fehérjék, vitaminok, antibiotikumok, hormonok előállítására, az élőlények genomjának szekvenálására és feltérképezésére, az egyének DNS-ének többszörös másolatának készítésére használják a törvényszéki vizsgálatokban stb.
1. ábra: Gének klónozása
Mi az a PCR?
A polimeráz láncreakció (PCR) egy olyan technika, amely egy adott DNS-fragmens nagyszámú másolatát állítja elő. Egy adott DNS-szekvencia exponenciális amplifikációja PCR-rel érhető el in vitro körülmények között. Ez a technika nagyon hatékony eszköz a molekuláris biológiában, mivel kis DNS-mintát képes felhasználható mennyiségre szaporítani. A PCR-t Kary Mullis vezette be 1983-ban, és ez a díjnyertes találmány hatalmas előrelépést hozott a molekuláris biológiában.
A PCR-technika ismételt PCR-reakciókat követ, amint az a 02. ábrán látható. Egy PCR-reakció három fő lépésből áll, amelyek három különböző hőmérsékleten játszódnak le; a kettős szálú DNS denaturálása 94 0C-on, a primerek összekapcsolása 68 0C-on és a szál meghosszabbítása 72 °C-on 0 C. Ezért a PCR végrehajtásakor a hőmérséklet-ingadozást nagymértékben fenn kell tartani a megfelelő replikáció érdekében. A PCR-t PCR-gépben, PCR-csövekben hajtják végre. A PCR csöveket megtöltjük megfelelő PCR-keverékekkel, amelyek templát DNS-t, Taq polimerázt, primereket, dNTP-ket és puffert tartalmaznak. A kétszálú minta DNS-ének egyszálú DNS-vé való denaturálása a komplementer bázisok közötti hidrogénkötések megszakításával történik 94-98 0C-on. Ezután a templát-DNS egyetlen szálát megvilágítják primerek számára. Egy pár alapozót (előre és hátra) kell biztosítani, és ezeknek hőstabilnak kell lenniük, hogy elviseljék a magas hőmérsékletet. A primerek egyszálú rövid DNS-szekvenciák, amelyek komplementerek a cél-DNS-fragmentum végeivel. A PCR-ben szintetikus primereket használnak. A primerek a minta DNS-ének komplementer bázisaihoz kötődnek, és elindítják egy új szál szintézisét. Ezt a lépést a Taq polimeráz nevű enzim katalizálja; a Thermus auqaticusból izolált hőstabil DNS polimeráz enzim. Ha primerek és nukleotidok (építőelemek) állnak rendelkezésre, a Taq polimeráz létrehozza az új DNS-szálat, amely komplementer a templát DNS-sel. A PCR program végén az amplifikált DNS-fragmenst gélelektroforézissel figyeljük meg. Ha további elemzésre van szükség, a PCR-terméket megtisztítjuk a gélből.
A PCR nagyon hasznos a genetikai és szerzett betegségek diagnosztizálásában és monitorozásában, a bűnözők azonosításában (a törvényszéki szakértők területén), a DNS célzott szegmensének szerkezetének és funkciójának tanulmányozásában, az organizmusok genomjainak szekvenálásában és feltérképezésében, stb. A PCR rutin laboratóriumi technikává vált az orvosi és molekuláris biológiai kutatólaboratóriumokban a tudósok körében, mivel számos alkalmazási területtel rendelkezik.
2. ábra: Polimeráz láncreakció
Mi a különbség a génklónozás és a PCR között?
Gén klónozás vs PCR |
|
| A génklónozás az a folyamat, amikor egy adott génről in vivo többszörös másolatot készítenek rekombináns DNS-en keresztül, és gazdabaktériummá alakulnak át. | A PCR-technika egy adott DNS-szekvencia többszörös másolatát állítja elő in vitro a PCR-reakciók ismételt ciklusaival. |
| Rekombináns DNS létrehozásának követelményei | |
| Rekombináns DNS-t állítanak elő a gén lokalizálása érdekében. | Rekombináns DNS nem termelődik. |
| Munkaszükséglet | |
| Ez a folyamat munkaigényes. | Intenzív munkára nincs szükség. |
| In vivo vagy In vitro eljárás | |
| A rekombináns DNS felépítése in vitro, a DNS amplifikációja pedig in vivo. | A DNS amplifikációja teljesen in vitro történik. |
Összefoglaló – Génklónozás kontra PCR
A génklónozás és a PCR a DNS-amplifikáció két módszere. A PCR egy in vitro eljárás, amely több másolatot készít egy adott DNS-fragmens DNS-éről anélkül, hogy rekombináns DNS-t és gazdaszervezetet használna. A génklónozás elsősorban egy in vivo folyamat, amely rekombináns DNS felépítése révén egy érdekelt gén többszörös másolatát eredményezi a gazdaszervezetben. Ez a különbség a génklónozás és a PCR között.
